人類胸腺核苷酸合成酶結(jié)構(gòu)及其與抑制劑相互作用關(guān)系.pdf

1、胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase,TS)能催化生物體內(nèi)的2’-脫氧尿苷-5’-磷酸(dUMP)甲基化形成2’-脫氧胸苷-5’-磷酸(dTMP),后者進一步在細胞內(nèi)代謝為脫氧胸苷三磷酸(dTTP),dTTP為DNA合成所必需的前體物質(zhì)。它是一種葉酸依賴性酶,是合成DNA所必需的前體物胸腺嘧啶脫氧核苷(dTMP)的關(guān)鍵酶,在細胞增殖中起重要的作用。抑制TS活性能抑制DNA的生物合成,進而抑制腫瘤細胞的增殖和生長。因此,

2、胸苷酸合成酶是腫瘤化學治療的熱門靶點,其抑制劑是抗腫瘤藥物研究的重要方向。研究胸苷酸合成酶的三維結(jié)構(gòu)、酶學性質(zhì),對研究TS與抑制劑的作用機理及開發(fā)新型抑制劑具有重要意義。
　　 本課題在人TS cDNA不發(fā)生定點突變的情況下,利用一系列分子生物學手段將其與表達載體pET-28b(+)連接得到重組表達載體TS-pET-28b(+),將重組質(zhì)粒TS-pET-28b(+)轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Transetta(DE3),鑒定并篩選出陽性轉(zhuǎn)化

3、子TS-pET-28b(+)/Transetta(DE3),重組大腸桿菌在發(fā)酵過程中加入誘導劑IPTG誘導表達,通過SDS-PAGE鑒別表明表達產(chǎn)物為含有6×His-tag融合標簽的重組人類胸苷酸合成酶。
　　 為了獲得高純度的、具有天然活性的人TS蛋白,本實驗利用重組人類TS蛋白中的6×His-tag融合標簽,通過固定金屬離子親和層析Ni-NTA進行特異性純化,獲得了純度為90％以上的TS蛋白。以純化得到的重組人TS純化液為原

4、料,利用氧化-還原轉(zhuǎn)化透析系統(tǒng)對其進行體外復性,復性得率為85.71%,使用操作簡單的透析復性方法成功實現(xiàn)了重組人TS的體外復性,獲得了具有正常活性的人TS,為進一步研究人TS提供足夠的酶來源。
　　 以利用氧化.還原轉(zhuǎn)化透析系統(tǒng)進行體外復性后的人TS為原料,通過紫外分光光度法測定酶活力,復性后hTS的酶活力為0.0186U,比活力為0.124U/mg。通過測定已知抑制劑培美曲塞(LY231514)和雷替曲塞(Tomudex)I

5、C50值分別為:5.7×10-6M、1.0×10-6M,分析現(xiàn)有hTS抑制劑雷替曲塞,培美曲塞等與酶相互作用后對hTS活性的影響,為分析測定計算機模擬的新型hTS抑制劑對hTS的抑制活性做好前期鋪墊。
　　 通過文獻查閱及實際探索,摸索了重組人TS結(jié)晶的條件,本實驗確定的最佳實驗條件如下,4℃條件下,母液成分組成為:30mM(NH4)2SO4,30%-40%PEG4000,0.2mM Tris-HCl,20mMβ-ME,PH8.