重組人FLT-3配體胞外區(qū)在畢赤氏酵母中的表達(dá)與鑒定.pdf

1、天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文重組人FLT3配體胞外區(qū)在畢赤氏酵母中的表達(dá)與鑒定姓名：黃宗堂申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：郝希山2002.5.1查堡墮型查竺堡主!!!至蘭堡圣我們根據(jù)畢赤氏酵母偏愛(ài)密碼子人工合成的FL胞外區(qū)cDNA序列經(jīng)測(cè)序。目的片段的編碼序列完全正確。重組FL胞外區(qū)cDNA以粘性末段連接方式定向克隆至pPIC9K質(zhì)粒的EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)，插入到質(zhì)粒中的a—MF分泌信號(hào)序列之后。重組質(zhì)粒pPIC9KFL經(jīng)測(cè)

2、序，插入片段大小、位置完全正確。Southern雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)目的基因已整和插入到宿主菌KM7l的基因組內(nèi)。Northern雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KM71pPIC9KFL菌株中經(jīng)O5％甲醇誘導(dǎo)后，目的基因已成功表達(dá)，而且目的基因表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加。經(jīng)O5％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，培養(yǎng)液上清中檢測(cè)到表達(dá)產(chǎn)物。Western雜交實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)了可被抗體特異性識(shí)別的雜交帶，證實(shí)此條帶即為重組畢赤氏酵母KM71pPIC9KFL分泌表達(dá)的重組FL蛋白。SD

3、SPAGE電泳結(jié)果顯示，KM71pPIC9KFL菌株表達(dá)的重組FL蛋白分子量大約為20KD。經(jīng)SDSPAGE凝膠掃描半定量分析，誘導(dǎo)表達(dá)96小時(shí)后，重組FL蛋白分泌量達(dá)到108mg／L。PNGaseF不完全酶切處理后重組FL蛋白依次脫除1至2個(gè)糖基，和未脫糖基產(chǎn)物共形成三個(gè)雜交帶，每個(gè)雜交帶分子量相差大約1KD，提示每個(gè)糖基化位點(diǎn)上大約有69個(gè)糖戡目的蛋白徹底脫糖基后，分子量大約為18KD，與1原核表達(dá)產(chǎn)物大小相當(dāng)J實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明畢赤氏酵