重組米曲霉單寧酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)與性質(zhì)分析.pdf

1、該研究嘗試用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行單寧酶的分泌表達(dá),將來自于米曲霉的單寧酶基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中,構(gòu)建成分泌型表達(dá)載體pPIC9K-TAN,然后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母菌株KM71中,得到的His<'+>菌株再用G41 8篩選抗性克隆,然后進(jìn)行搖瓶表達(dá),探討了在不同pH條件下進(jìn)行誘導(dǎo)以及不同甲醇濃度對(duì)單寧酶表達(dá)量的影響.鑒于畢赤酵母適合于高密度發(fā)酵的特點(diǎn),我們還進(jìn)行了重組單寧酶的高密度發(fā)酵表達(dá).發(fā)酵液上清經(jīng)超慮濃縮后用DEAE陰離

2、子交換層析純化,每升發(fā)酵液可得約72mg單寧酶樣品.對(duì)重組單寧酶進(jìn)行去糖基化分析,從SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,在去糖基化后進(jìn)行非還原性電泳時(shí),單寧酶的遷移率大約為68kDa,而在進(jìn)行還原性電泳時(shí),則清楚顯示出重組單寧酶由34kDa和31kDa兩個(gè)亞基構(gòu)成.我們還對(duì)重組單寧酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析,測(cè)定重組單寧酶的酶活力為1.5×10<'4>U/g.并對(duì)其熱穩(wěn)定性范圍,最適反應(yīng)溫度,酸堿穩(wěn)定范圍,最適反應(yīng)pH等進(jìn)行了分析.由于甲醇具有一

3、定的毒性,且是易燃物質(zhì),存在一定的危險(xiǎn)性,而組成型啟動(dòng)子P<,GAP>是近年來成功克隆并得以應(yīng)用的畢赤酵母高效啟動(dòng)子,為了探討使用該啟動(dòng)子表達(dá)單寧酶的可行性,并探討載體信號(hào)肽序列與單寧酶基因之間的序列對(duì)單寧酶的表達(dá)及其N端序列的影響,我們構(gòu)建了表達(dá)載體pGAPZαA-TAN及pGAPZαA-ETAN,其中pGAPZαA-TAN中信號(hào)肽序列與單寧酶基因直接相連,在pGAPZαA-ETAN中,信號(hào)肽序列與單寧酶基因之間保留了Ste13蛋白酶