菊粉酶基因克隆及在畢赤酵母中表達(dá).pdf

1、菊粉酶是一類是能水解13-2,1-D-果聚糖果糖苷鍵的水解酶,屬于GH32糖苷水解酶家族,菊粉酶在微生物和植物中廣泛存在。上個(gè)世紀(jì)20年代,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)某些微生物能發(fā)酵菊芋,1991年成功利用分子生物學(xué)方法克隆得到菊粉酶基因。此后菊粉酶的功能、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)引起了研究人員的興趣。但是至今研究還未完全揭示菊粉酶蛋白所有性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征。菊粉酶根據(jù)水解菊粉方式不同,分為內(nèi)切菊粉酶和外切菊粉酶,它們分別水解菊粉得到的低聚果糖和果糖,兩種產(chǎn)品在工業(yè)生產(chǎn)

2、中都有應(yīng)用。利用基因工程手段將菊粉酶基因在畢赤酵母中表達(dá)并高密度發(fā)酵生產(chǎn)得到高濃度的菊粉酶蛋白是生產(chǎn)低聚果糖和果糖的有效方法,能降低成本,提高利用率。本論文首先通過(guò)引物設(shè)計(jì)從馬科斯克魯維酵母染色體上克隆得到包括INU1基因ORF在內(nèi)的菊粉酶基因大片段,再以大片段基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增INU1基因的ORF。利用‘TA’克隆將INU1片段與pEASY T3載體連接,構(gòu)建了在大腸桿菌中復(fù)制的pEASY T3-INU1重組載體。利用限制性內(nèi)切酶切重組T

3、3-INU1載體和pPIC9載體,得到有相同粘性末端的INU1片段和線性的pPIC9,利用連接酶將兩片段連接,構(gòu)建了能在大腸桿菌和畢赤酵母中復(fù)制表達(dá)的穿梭質(zhì)粒pPIC9-INU1。論文第二部分是將線性化的pPIC9-INU1載體通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移至畢赤酵母中,利用載體5’AOX基因與畢赤酵母染色體上5’AOX基因的同源性,將其同源重組。重組轉(zhuǎn)化子含有HTS4基因,能在無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),利用組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選畢赤酵母重組轉(zhuǎn)化子。

4、PCR驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。實(shí)驗(yàn)利用甲醇作為唯一碳源和誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化子表達(dá)重組菊粉酶蛋白。濃縮發(fā)酵液上清中的蛋白,利用SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)酵液中蛋白表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)化子能大量表達(dá)重組酶蛋白,并利用載體自身的信號(hào)肽將蛋白分泌到細(xì)胞外。利用DNS方法檢測(cè)重組酶活性,搖瓶發(fā)酵轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶量不斷提高,在163h時(shí)酶活性達(dá)到峰值,達(dá)到10.168U,將4號(hào)轉(zhuǎn)化子接種到5L發(fā)酵罐中培養(yǎng),酶活達(dá)到12.458U/ml。菌體OD600達(dá)到39