卡吾爾鏈霉菌TJ430高產(chǎn)菌株選育研究.pdf

1、本文以獲得的一株編號(hào)為TJ430的卡吾爾鏈霉菌為原始出發(fā)菌株，該菌株能夠產(chǎn)生一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，該抗生素前人未報(bào)道過(guò)。在溫室內(nèi)對(duì)該抗生素的生物活性測(cè)試表明，其150ppm水溶液對(duì)番茄晚疫病、番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病、黃瓜菌核病及黃瓜炭疽病的防效分別為100％、79.36％，98.11％和75.79％。結(jié)果表明，菌株TJ430產(chǎn)生的抗生素具有廣泛的抗菌譜和良好的抗菌活性，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。
　　由于該原始菌株抗生素產(chǎn)量較低無(wú)法滿足工業(yè)化

2、生產(chǎn)需求，本文采用核糖體工程技術(shù)對(duì)該菌株進(jìn)行誘變，以期提高抗生素產(chǎn)量。
　　本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建高產(chǎn)菌株篩選模型，本實(shí)驗(yàn)采用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板作為篩選平板，并對(duì)其可行性做了研究。結(jié)果表明，抗生素產(chǎn)量受接種量影響可忽略不計(jì)，差異系數(shù)控制在20％，當(dāng)菌株在篩選模型上生長(zhǎng)7天時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高，浸提時(shí)采用4∶1的甲醇水浸提2min抗生素提取效率最高。以上數(shù)據(jù)顯示，采用24孔板作為抗生素篩選模型是可行的。該模型能快速篩選高產(chǎn)菌株，具有省時(shí)省力，篩選速度快

3、等優(yōu)點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)采用五因素四水平正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究。實(shí)驗(yàn)采用葡萄糖作為碳源，蛋白胨、酵母粉、豆粕作為氮源，CaCO3作為無(wú)機(jī)鹽，根據(jù)五種用料的極差值趨勢(shì)圖獲得優(yōu)化后的發(fā)酵配方為:葡萄糖1.9％、蛋白胨0.6％、豆粕0.3％、酵母粉0.15％、CaCO30.015％。在發(fā)酵過(guò)程中添加0.05％PVA能顯著提高產(chǎn)量。采用單因素實(shí)驗(yàn)，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間為4天，初始pH為8.5，培養(yǎng)溫度為28℃，接種量為5％、轉(zhuǎn)速

4、為200rpm。最終優(yōu)化配方產(chǎn)量比原始發(fā)酵培養(yǎng)基提高5倍。
　　本實(shí)驗(yàn)采用核糖體工程技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行了誘變研究。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別采用鏈霉素、利福平和慶大霉素作為誘變劑對(duì)菌株進(jìn)行誘變，經(jīng)過(guò)四輪誘變，共獲得再生單菌落956個(gè)，經(jīng)過(guò)模型初篩，獲得正向突變株45株，負(fù)向突變株1株。正突變量約為4.7％，其中慶大-136、利福平-147、利福平-235、利福平-238、利福平-297抗生素產(chǎn)量達(dá)到300％以上，慶大-138更是高達(dá)400％以上

5、。經(jīng)過(guò)復(fù)篩，有9株菌株保持穩(wěn)定，其中有8株為正突變菌株，有1株為負(fù)突變菌株。正突變菌株產(chǎn)量約為原始出發(fā)菌株的1.5倍，負(fù)突變菌株，較原始菌株產(chǎn)量抗生素產(chǎn)量降低了61.8％。
　　本實(shí)驗(yàn)從分子水平上對(duì)菌株抗菌機(jī)制進(jìn)行了研究。對(duì)9株經(jīng)利福平和慶大霉素誘變獲得的突變株靶標(biāo)位點(diǎn)(ropB基因)進(jìn)行基因提取、PCR擴(kuò)增、以及基因測(cè)序。在正向突變株ropB基因序列中未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，而在負(fù)突變菌株ropB基因序列中發(fā)生了點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)位于ro