卡吾爾鏈霉菌TJ430高產(chǎn)菌株選育研究.pdf

1、本文以獲得的一株編號為TJ430的卡吾爾鏈霉菌為原始出發(fā)菌株，該菌株能夠產(chǎn)生一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，該抗生素前人未報道過。在溫室內(nèi)對該抗生素的生物活性測試表明，其150ppm水溶液對番茄晚疫病、番茄細菌性斑點病、黃瓜菌核病及黃瓜炭疽病的防效分別為100％、79.36％，98.11％和75.79％。結(jié)果表明，菌株TJ430產(chǎn)生的抗生素具有廣泛的抗菌譜和良好的抗菌活性，具有廣闊的開發(fā)前景。
　　由于該原始菌株抗生素產(chǎn)量較低無法滿足工業(yè)化

2、生產(chǎn)需求，本文采用核糖體工程技術對該菌株進行誘變，以期提高抗生素產(chǎn)量。
　　本實驗構建高產(chǎn)菌株篩選模型，本實驗采用24孔細胞培養(yǎng)板作為篩選平板，并對其可行性做了研究。結(jié)果表明，抗生素產(chǎn)量受接種量影響可忽略不計，差異系數(shù)控制在20％，當菌株在篩選模型上生長7天時產(chǎn)量達到最高，浸提時采用4∶1的甲醇水浸提2min抗生素提取效率最高。以上數(shù)據(jù)顯示，采用24孔板作為抗生素篩選模型是可行的。該模型能快速篩選高產(chǎn)菌株，具有省時省力，篩選速度快

3、等優(yōu)點。
　　本實驗采用五因素四水平正交實驗法對菌株發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化研究。實驗采用葡萄糖作為碳源，蛋白胨、酵母粉、豆粕作為氮源，CaCO3作為無機鹽，根據(jù)五種用料的極差值趨勢圖獲得優(yōu)化后的發(fā)酵配方為:葡萄糖1.9％、蛋白胨0.6％、豆粕0.3％、酵母粉0.15％、CaCO30.015％。在發(fā)酵過程中添加0.05％PVA能顯著提高產(chǎn)量。采用單因素實驗，確定最佳培養(yǎng)時間為4天，初始pH為8.5，培養(yǎng)溫度為28℃，接種量為5％、轉(zhuǎn)速

4、為200rpm。最終優(yōu)化配方產(chǎn)量比原始發(fā)酵培養(yǎng)基提高5倍。
　　本實驗采用核糖體工程技術對菌株進行了誘變研究。在實驗過程中分別采用鏈霉素、利福平和慶大霉素作為誘變劑對菌株進行誘變，經(jīng)過四輪誘變，共獲得再生單菌落956個，經(jīng)過模型初篩，獲得正向突變株45株，負向突變株1株。正突變量約為4.7％，其中慶大-136、利福平-147、利福平-235、利福平-238、利福平-297抗生素產(chǎn)量達到300％以上，慶大-138更是高達400％以上

5、。經(jīng)過復篩，有9株菌株保持穩(wěn)定，其中有8株為正突變菌株，有1株為負突變菌株。正突變菌株產(chǎn)量約為原始出發(fā)菌株的1.5倍，負突變菌株，較原始菌株產(chǎn)量抗生素產(chǎn)量降低了61.8％。
　　本實驗從分子水平上對菌株抗菌機制進行了研究。對9株經(jīng)利福平和慶大霉素誘變獲得的突變株靶標位點(ropB基因)進行基因提取、PCR擴增、以及基因測序。在正向突變株ropB基因序列中未發(fā)現(xiàn)突變位點，而在負突變菌株ropB基因序列中發(fā)生了點突變，突變位點位于ro