金針菇LP03液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的研究.pdf

1、漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,能催化氧化胺類、酚類物質(zhì)等多種不同底物的反應(yīng),在環(huán)境、食品、醫(yī)藥等行業(yè)獲得廣泛應(yīng)用。采用單因素法選擇合適的碳源、氮源及初步確定合適的金針菇LP03液體培養(yǎng)產(chǎn)漆酶的條件,并通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化以提高漆酶產(chǎn)量。運(yùn)用2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)法測(cè)定漆酶活力,并確定其最佳反應(yīng)條件。利用發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),然后采用DEAE Sephadex A-25和Sepharos

2、e4B對(duì)發(fā)酵液中的漆酶進(jìn)行分離提純。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)在液體培養(yǎng)條件下,考察了碳源、氮源、Cu2+以及培養(yǎng)條件等因素對(duì)金針菇產(chǎn)漆酶的影響。結(jié)果表明,以3％玉米粉為碳源,1%蛋白胨為氮源,添加1mmol/L的硫酸銅,初始pH值6.0、裝液量200 mL/500 mL三角瓶、28℃、160 r/min條件下培養(yǎng),漆酶產(chǎn)量最高,菌株產(chǎn)酶活力為1813.52±5.59 U/L。
　　(2)利用Plackett-Bu

3、rman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到影響金針菇LP03產(chǎn)漆酶的顯著性因素,蛋白胨、葡萄糖、MgSO4·7H2O濃度、pH值及裝液量對(duì)漆酶的生產(chǎn)影響顯著,結(jié)合響應(yīng)面方法中的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)五個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化以提高漆酶產(chǎn)量,最佳實(shí)驗(yàn)條件為蛋白胨1.75%,葡萄糖0.46%,MgSO4·7H2O0.0798%,pH6.11,裝液量222.4mL,在此條件下獲得最高酶活為2920.33±42U/L,與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比酶活提高了4.85倍。
　　(3)采用稀

4、硫酸、稀醋酸以及水對(duì)秸稈進(jìn)行水解,稀硫酸的水解效果較好。采用單因素實(shí)驗(yàn)以及正交實(shí)驗(yàn)對(duì)稀硫酸水解條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明水解時(shí)間對(duì)水解影響最大。最佳水解條件為:水解時(shí)間1h、稀硫酸濃度5%、固液比1:15、溫度120℃,并利用水解液作為發(fā)酵液進(jìn)行金針菇 LP03深層液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶,獲得最高酶活為1410.3 U/L。
　　(4)在液體培養(yǎng)條件下,考察了酚類、胺類、氨基及表面活性劑等外源刺激物對(duì)金針菇LP03漆酶分泌的影響。結(jié)果表明,

5、不同的刺激物對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶有不同程度的影響。添加愈創(chuàng)木酚、2,4-二硝基酚和單寧酸對(duì)金針菇LP03的漆酶分泌有明顯的誘導(dǎo)作用,漆酶最高酶活比對(duì)照組分別提高了17%、16.6%和20.4%。苯酚、間苯二酚、氨基酸及VB1對(duì)漆酶分泌無(wú)明顯誘導(dǎo)作用,而DMP、焦性沒(méi)食子酸及表面活性劑對(duì)漆酶的分泌有抑制作用。酚類物質(zhì)對(duì)菌體生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用,而其他物質(zhì)對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。
　　(5)通過(guò)對(duì)金針菇LP03液體發(fā)酵的粗酶液進(jìn)行離心、硫酸