中國(guó)布氏菌的多位點(diǎn)序列分型研究.pdf

1、目的：在原有的7個(gè)管家基因和1個(gè)外膜蛋白的基礎(chǔ)上，新增加Ⅳ型分泌系統(tǒng)中的兩個(gè)毒力因子，利用多個(gè)管家基因的序列進(jìn)行分型，建立一種適用于布氏菌的分辨率較高的ST分型方法，用于中國(guó)布氏菌分離株的分型，了解菌株的遺傳特征及遺傳進(jìn)化關(guān)系，為我國(guó)布氏菌分子流行病學(xué)的研究提供依據(jù)。
　　 方法：以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)，應(yīng)用測(cè)序技術(shù)進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型（Multiple locussequence typing，MLST）研究。選取1953年到20

2、10年我國(guó)不同地區(qū)分離到的164株布氏菌分離株和3株疫苗株作為研究對(duì)象。通過(guò)對(duì)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株的比較評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性，用血清學(xué)、噬菌體等方法對(duì)164株分離株進(jìn)行再次鑒定驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可靠性。在此基礎(chǔ)上對(duì)164株布氏菌分離株和3株疫苗株的10對(duì)目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，對(duì)比得到各目的基因的等位基因，從而判定其ST 型，利用MLST在線工具（NRDB、LIAN、eBURST、Tree drawing），對(duì)序列的等位基因型、序列型分離、連鎖平衡、聚類

3、、進(jìn)化樹等進(jìn)行分析，確定序列型、了解菌株間的進(jìn)化關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 （1）以布氏菌屬的17株國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株作為參照，結(jié)果顯示：菌株的完全符合率為81.25％，等位基因的符合率為96.88％。有差別的為羊種菌63/9（cobQ）、牛種菌86/8/59（glk）、牛種菌Tulya（aroA）、綿羊附睪種菌5K33（omp25）；
　　 經(jīng)過(guò)血清學(xué)、噬菌體等方法對(duì)164株分離株進(jìn)行復(fù)檢，均與原始結(jié)果相一致。

4、>　　 （2）應(yīng)用MLST分型方法將164株布氏菌和3株疫苗株共分為38個(gè)ST 型，得到了38個(gè)ST 型的等位基因譜，其中牛種菌分為13個(gè)型，羊種菌分為8個(gè)型，豬種菌分為11個(gè)型，犬種菌分為6個(gè)型，ST-37中既有豬種菌又有犬種菌；疫苗株S2 被單獨(dú)分為一個(gè)型。
　　 （3）分析實(shí)驗(yàn)菌株等位基因多態(tài)性結(jié)果顯示：omp25 多態(tài)性變異程度最大，10個(gè)位點(diǎn)gap、aroA、glk、dnaK、gyrB、trpE、cobQ、omp25

5、、VirB5和VirB8的遺傳多態(tài)性分別為0.6612、0.7867、0.7286、0.5663、0.7035、0.4110、0.7114、0.8996、0.6659、0.5780。
　　 （4）將38個(gè)ST 進(jìn)行分裂分解、N-J 計(jì)算方法繪制進(jìn)化樹以及eBRUST分析，顯示羊種菌和牛種菌各聚為一簇，犬種和豬種菌聚在一起。表明牛種、羊種的各自生物型在基因水平上是高度保守的，各自的種相對(duì)獨(dú)立，具有更高的相似性，而豬種與犬種之間的親

6、緣關(guān)系相近。同時(shí)也提示，布氏菌的ST 型太少，難分析出不同型間的變異關(guān)系，從另一方面表明，布氏菌是一個(gè)高度保守的細(xì)菌，ST 型變異小。
　　 結(jié)論：
　　 （1）選取了10個(gè)管家基因，初步建立了一種新的分類學(xué)方法，為建立中國(guó)布氏菌分離株的MLST 數(shù)據(jù)庫(kù)提供了豐富的數(shù)據(jù)資料。
　　 （2）將菌株的生物型別與得到的ST 型相比較，發(fā)現(xiàn)布氏菌的生物型與ST型之間無(wú)明顯的相關(guān)性。MLST的分型結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了犬種布氏菌