海水養(yǎng)殖魚哈維弧菌分離株多位點(diǎn)序列分析及耐藥譜型研究.pdf

1、哈維弧菌（Vibrio harveyi）是一種革蘭氏陰性菌，廣泛分布于海水養(yǎng)殖環(huán)境，能夠在有利條件下感染水產(chǎn)動(dòng)物，引起宿主復(fù)雜多樣的臨床致病癥狀，造成非常高的死亡率，給水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大打擊。然而，此菌與其類似菌種如坎氏弧菌、副溶血弧菌等具有極其高的表型和基因型相似度，對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定分型存在諸多困難。此外，對(duì)該菌的耐藥譜型特點(diǎn)進(jìn)行研究可為流行病學(xué)調(diào)查和合理用藥提供指導(dǎo)，是許多研究者目前關(guān)注的重點(diǎn)。本研究利用多位點(diǎn)序列分析法對(duì)采

2、集自2007-2012年我國(guó)南方沿海地區(qū)患病海水魚的哈維弧菌分離株進(jìn)行鑒定分型，探究多基因位點(diǎn)序列對(duì)哈維弧菌類似群的區(qū)分力及哈維弧菌分離株多基因位點(diǎn)分型情況。采用K-B法對(duì)鑒定的哈維弧菌分離株進(jìn)行12種抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)，研究其耐藥譜型特點(diǎn)，運(yùn)用耐藥性情況SPSS聚類分析進(jìn)一步對(duì)哈維弧菌分離株進(jìn)行分型，探究分型的菌株的耐藥性特征。結(jié)果如下：
　　1.利用6個(gè)保守基因位點(diǎn)16S rRNA、mreB、rctB、rpoD、topA、to

3、xR分別對(duì)210株采樣分離株進(jìn)行測(cè)序鑒定。通過(guò)PCR、測(cè)序比對(duì)得到95株哈維弧菌類似群菌株，7株創(chuàng)傷弧菌菌株；基因序列的進(jìn)化分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建表明，除toxR基因外，其余基因在進(jìn)化過(guò)程中均存在基因重組事件，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中不能將哈維弧菌類似群菌株完全區(qū)分；各基因序列在哈維弧菌種內(nèi)遺傳相似度分別為99.1~100％（16S rRNA）、91.1~100%（mreB）、98.5~100%（rctB）、87.1~100%（rpoD）、86.6～

4、100%（topA）、98.4～100%（toxR），在哈維弧菌類似群菌株間的種間遺傳相似度依次為98.4～99.9%（16S rRNA）（不包括V. communis）、87.0~98.4%（mreB）、73.2～98.9%（rctB）、80.8~100%（rpoD）、75.9~100%（topA）、24.4～78.9%（toxR）；基因的區(qū)分力為，毒力蛋白編碼基因toxR＞保守蛋白編碼基因（mreB、rctB、rpoD、topA）＞

5、16S rRNA。
　　2.基于串聯(lián)基因序列進(jìn)化分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，串聯(lián)基因序列分析能夠降低重組基因事件的影響，將哈維弧菌類似菌株在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中有效的分支，其中rctB-toxR基因的串聯(lián)在進(jìn)化樹(shù)中的分支結(jié)果與mreB-rctB-rpoD-topA-toxR串聯(lián)的一致，均能最好的將哈維弧菌類似群菌株區(qū)分，最終獲得哈維弧菌分支包括84株分離株，占分離株的40.0%；V. communis分支含有2株分離株（0.95%）；2株分

6、離株聚為副溶血弧菌；4株分離株歸為輪蟲弧菌（1.9%）；3株分離株鑒定為溶藻弧菌（1.4%）。
　　3.基于5基因（mreB-rctB-rpoD-topA-toxR）串聯(lián)分析的哈維弧菌分離株分型情況發(fā)現(xiàn)，84株哈維弧菌分為a-k共11個(gè)亞支，各亞支菌株來(lái)源分布各有特點(diǎn)，其中，a、b、c亞支均只有一株，分別分離自2010、2011年廣東地區(qū)養(yǎng)殖的患病卵形鯧鲹及2011年福建地區(qū)養(yǎng)殖的患病紅鰭笛鯛；d亞支含有18株分離株，占21.4%

7、，其石斑魚分離株均分離至海南地區(qū)，而卵形鯧鲹及點(diǎn)籃子魚分離株均來(lái)源于廣東地區(qū)；e亞支的6株菌株均分離自患病的卵形鯧鲹；f亞支的7株分離株均采集于2011年；g亞支的4株分離株全部來(lái)自廣東地區(qū)；聚為h亞支的15株分離株包含的宿主種類多達(dá)7種（包括4種不同的石斑魚種類）；i亞支包括參考菌株V. harveyi ATCC33868與尖吻鱸分離株104CCL；j亞支由2株紅鰭笛鯛分離株、8株石斑魚分離株、標(biāo)準(zhǔn)株V. harveyi ATCC14

8、126、參考株V. harveyi LMG4044構(gòu)成；k亞支包括20株分離株，占23.8%，從采集地域看，4株廣西地區(qū)分離株均聚在該亞支中，從采集的年份看，2010年的分離株（除72BKI外）亦均聚在該亞支，2012年的菌株僅有1株分布于此分支中，從分離的宿主看，該亞支90.0%（18株）的菌株從石斑魚上獲得?？梢?jiàn)，來(lái)源不同的分離株可以聚落為同一亞支，相同來(lái)源的分離株也可以分布在不同的亞支中，這表明來(lái)源不同的哈維弧菌分離株可以具有相似

9、的基因型，來(lái)源相同的哈維弧菌分離株的基因型存在差異。
　　4.哈維弧菌菌株的12種抗生素耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，哈維弧菌分離株有A-Z共26種耐藥譜型，譜型豐富度為31.0%；多重耐藥譜型數(shù)量（耐藥種數(shù)3種以上）為13種，占總耐藥譜型數(shù)量的50.0%，譜型豐富度達(dá)59.1%。海南、廣東、廣西、福建的分離株分別包含有18種、15種、3種、1種耐藥譜型，四個(gè)地區(qū)均具有J型（FUR/AMO）耐藥譜；2007-2012年的分離株耐藥譜型及耐藥

10、抗生素種類依次為J、M（耐2種抗生素），A、B、J、M（耐5種抗生素），除Y、Z外的A-X耐藥譜型（耐7種抗生素），包括Y、Z耐藥譜型（耐8種抗生素）；青石斑魚、棕點(diǎn)石斑魚、鰓棘鱸、卵形鯧鯵、珍珠龍躉分離株的耐藥譜型數(shù)量為6-10種，其余宿主的分離株耐藥譜型數(shù)量?jī)H為1-3種。聚類分析先將實(shí)驗(yàn)菌株分為i-vi共6個(gè)亞群，進(jìn)而聚類為GroupI、GroupII兩個(gè)組群；各亞群菌株具有獨(dú)特的耐藥譜型，耐藥譜型分別是N、P、T、U、Y（i亞群）