中國部分地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌多位點(diǎn)序列分型及碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制研究.pdf

1、碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(Carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)在我國各地的廣泛出現(xiàn)和流行，給臨床治療帶來了極大的困難。應(yīng)用分子分型技術(shù)對(duì)我國各個(gè)地區(qū)的CRAB進(jìn)行系統(tǒng)全面的分子流行病學(xué)研究，闡明我國CRAB的流行分布情況，將為制訂科學(xué)、有效的預(yù)防和控制措施提供理論依據(jù)。
　　 本研究第一部分收集了2005年中國16個(gè)城市24家三級(jí)醫(yī)院的分離的226株非重復(fù)的鮑曼

2、不動(dòng)桿菌，包括152株CRAB菌株和74株碳青霉烯類抗生素敏感鮑曼不動(dòng)桿菌(Carbapenem-susceptibleAcinetobacterbaumannii，CSAB)，應(yīng)用多位點(diǎn)序列分型(Multilocussequencetyping，MLST)技術(shù)對(duì)這些菌株進(jìn)行分子分型，并將結(jié)果與細(xì)菌分子分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)結(jié)果進(jìn)行比較，分析MLST技

3、術(shù)應(yīng)用于鮑曼不動(dòng)桿菌分子流行病研究的可行性；應(yīng)用eBURST軟件對(duì)MLST數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，推測(cè)菌株的進(jìn)化關(guān)系，并與國外鮑曼不動(dòng)桿菌MLST分型結(jié)果進(jìn)行比較分析；測(cè)定了11種抗菌藥物的體外敏感性試驗(yàn)；應(yīng)用PCR檢測(cè)了菌株攜帶的碳青霉烯類抗生素耐藥基因。
　　 MLST結(jié)果顯示，CRAB菌株的遺傳背景相對(duì)單一，包含8個(gè)序列型(Sequencetype，ST)，其中ST92及其單個(gè)位點(diǎn)變異型(Singlelocusvariant，SLV

4、)ST90和ST75為主要流行ST型，其次為ST91型。CSAB菌株具有更多樣性的遺傳背景，包含36個(gè)ST型，ST92也是CSAB菌株中最主要的ST型。
　　 PFGE將226株鮑曼不動(dòng)桿菌分為44個(gè)脈沖型。整體上看，PFGE與MLST的結(jié)果具有較好的一致性，但是在對(duì)ST92及其SLVs菌株的區(qū)分上，PFGE和MLST存在部分的差異。與PFGE相比，MLST對(duì)菌株同源性的判定更為保守，可以反映菌株較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系。
　

5、　 將MLST數(shù)據(jù)與鮑曼不動(dòng)桿菌網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫Pubmlst(http://pubmlst.org/abaumannii/)中數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)ST92及其SLVs屬于克隆復(fù)合體92(Clonalcomplex92，CC92，原名CC22)，是目前數(shù)據(jù)庫中最主要克隆復(fù)合體，其菌株來源包括了亞洲、歐洲、大洋洲和美洲的多個(gè)國家，證實(shí)CC92存在世界性的廣泛流行，且中國流行的CRAB菌株與國外流行的菌株在進(jìn)化上來自于相同的祖先。
　　

6、 CC92和ST91型鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類、第三和第四代頭孢菌素、氨基糖苷類、米諾環(huán)素和氟喹諾酮的耐藥性均要高于其他ST型鮑曼不動(dòng)桿菌(P<0.001)。ST92-CRAB與ST92-CSAB相比，除碳青霉烯類抗生素以外，對(duì)以上其他抗菌藥物的耐藥率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示多重耐藥是ST92型菌株的重要特征。
　　 blaOXA-23是CRAB菌株攜帶的最主要的獲得性的碳青霉烯酶基因。ST91型CRAB菌株同時(shí)攜帶了blaOXA-

7、23和blaOXA-58。CSAB菌株中均未檢測(cè)到獲得性的碳青霉烯酶基因。blaOXA-23陽性的ST92型CRAB菌株對(duì)亞胺培南的最小抑菌濃度(Minimalinhibitoryconcentration，MIC)是blaOXA-23陰性的ST92型CSAB菌株的32-128倍，提示blaOXA-23是造成ST92型鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的關(guān)鍵因素。
　　 本研究第一部分應(yīng)用了MLST分型技術(shù)對(duì)國內(nèi)多個(gè)城市的鮑曼不

8、動(dòng)桿菌進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)克隆復(fù)合體CC92是我國甚至全球流行范圍最廣的CRAB克隆，且具有很強(qiáng)的耐藥性。OXA-23型碳青霉烯酶基因是介導(dǎo)CC92對(duì)該類抗生素耐藥的重要因素。CC92在國內(nèi)的出現(xiàn)和播散是我國鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥率不斷升高的重要原因。
　　 具有碳青霉烯類抗生素水解能力的D類β-內(nèi)酰胺酶(CarbapenemhydrolyzingclassDβ-lactamase，CHDL)是介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌

9、對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的最重要機(jī)制。blaOXA-58是一種呈全球分布的CHDL基因。本研究第一部分發(fā)現(xiàn)ST91型CRAB同時(shí)攜帶了blaOXA-23型和blaOXA-58型碳青霉烯酶基因。第二部分在此基礎(chǔ)上，對(duì)攜帶blaOXA-58基因的不動(dòng)桿菌的遺傳背景特征、質(zhì)粒特征及blaOXA-58基因的周圍結(jié)構(gòu)與耐藥表型間的聯(lián)系進(jìn)行了深入研究。
　　 第二部分研究收集了13株攜帶blaOXA-58基因的非重復(fù)的不動(dòng)桿菌，來自自國內(nèi)6個(gè)

10、城市的7家三級(jí)醫(yī)院，包括了2株pittii不動(dòng)桿菌(即不動(dòng)桿菌基因種型3)，3株nosocomialis不動(dòng)桿菌(即不動(dòng)桿菌基因種型13TU)和8株鮑曼不動(dòng)桿菌(其中兩株浙江金華的鮑曼不動(dòng)桿菌來自在第一部分研究)。應(yīng)用PFGE和MLST對(duì)這些菌株進(jìn)行分子流行病學(xué)研究；測(cè)定所有菌株對(duì)13種抗菌藥物的MIC值；應(yīng)用Southern雜交確定blaOXA-58的基因定位；應(yīng)用質(zhì)粒抽提和電轉(zhuǎn)化確定攜帶blaOXA-58質(zhì)粒的可傳播性；應(yīng)用限制性酶

11、切、克隆技術(shù)分析blaOXA-58的基因周圍序列；應(yīng)用基于PCR的鮑曼不動(dòng)桿菌質(zhì)粒復(fù)制子分型法(AcinetobacterbaumanniiPCR-basedreplicontyping，AB-PBRT)對(duì)不同菌株中攜帶blaOXA-58的質(zhì)粒進(jìn)行分型研究。
　　 PFGE分型發(fā)現(xiàn)，2株pittii不動(dòng)桿菌屬于同一個(gè)脈沖型(分別來自浙江杭州和浙江臺(tái)州)，3株nosocomialis不動(dòng)桿菌分屬于2個(gè)脈沖型(均來自浙江溫州)，8株

12、鮑曼不動(dòng)桿菌可分為3個(gè)脈沖型。8株鮑曼不動(dòng)桿菌可分為3個(gè)ST型。其中，ST91在浙江金華和湖北武漢的醫(yī)院出現(xiàn)，且浙江金華中心醫(yī)院2004年和2009年均分離到了ST91型產(chǎn)OXA-58型碳青霉烯酶的鮑曼不動(dòng)桿菌，提示其存在地方性流行。
　　 13株不動(dòng)桿菌表現(xiàn)出不同的碳青霉烯類抗生素敏感性表型。pittii不動(dòng)桿菌和nosocomialis不動(dòng)桿菌均為碳青霉烯類抗生素敏感。而鮑曼不動(dòng)桿菌中僅有一株為碳青霉烯類抗生素敏感，其余均為

13、耐藥。同時(shí)，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)第三代和四代頭孢菌素、含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑、氨基糖苷類、米諾環(huán)素和環(huán)丙沙星的耐藥性均要高于pittii不動(dòng)桿菌和nosocomialis不動(dòng)桿菌。
　　 Southern雜交結(jié)果顯示，13株不動(dòng)桿菌中blaOXA-58基因均定位于質(zhì)粒上，質(zhì)粒大小范圍在52kb～305kb之間。除了305kb的質(zhì)粒外，其余質(zhì)粒均可通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移到碳青霉烯類抗生素敏感的鮑曼不動(dòng)桿菌受體菌中。應(yīng)用AB-PBRT分型

14、法發(fā)現(xiàn)，這些質(zhì)粒不屬于已知的質(zhì)粒復(fù)制子分型。確認(rèn)了2株pittii不動(dòng)桿菌，3株nosocomialis不動(dòng)桿菌和2株鮑曼不動(dòng)桿菌中攜帶blaOXA-58基因的質(zhì)粒屬于一種新的質(zhì)粒復(fù)制子分型，命名為Aci10。
　　 對(duì)blaOXA-58基因的周圍序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在blaOXA-58基因的上游存在類似插入序列(Insertionsequence，IS)ISAba3的ISAba3-like結(jié)構(gòu)。部分菌株的ISAba3-like結(jié)

15、構(gòu)被IS6家族的插入序列打斷，形成IS6family-△ISAba3-like-blaOXA-58的特殊結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)僅出現(xiàn)在7株碳青霉烯類抗生素耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌和1株碳青霉烯類抗生素敏感的nosocomialis不動(dòng)桿菌中，且具有此結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入鮑曼不動(dòng)桿菌受體菌后介導(dǎo)了受體菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥或中介。其余碳青霉類抗生素敏感的不動(dòng)桿菌中blaOXA-58基因的上游的ISAba3-like結(jié)構(gòu)未被其他IS序列打斷。啟動(dòng)子

16、分析發(fā)現(xiàn)，IS6family-△ISAba3-like結(jié)構(gòu)為下游blaOXA-58的表達(dá)提供了強(qiáng)啟動(dòng)子，在介導(dǎo)碳青霉烯類抗生素耐藥中起了重要作用。部分菌株blaOXA-58基因的周圍序列中發(fā)現(xiàn)了重組位點(diǎn)序列，提示blaOXA-58基因的轉(zhuǎn)移可能和重組事件有關(guān)。ST91型鮑曼不動(dòng)桿菌blaOXA-58基因的下游同時(shí)發(fā)現(xiàn)了攜帶氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶基因aphA6的復(fù)合轉(zhuǎn)座子TnaphA6。aphA6隨blaOXA-58基因進(jìn)行傳播使受體菌同時(shí)

17、獲得對(duì)碳青霉烯類抗生素和氨基糖苷類抗生素的耐藥能力。
　　 本研究第二部分發(fā)現(xiàn)blaOXA-58基因可存在于pittii不動(dòng)桿菌、nosocomialis不動(dòng)桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌中，且均定位于質(zhì)粒上，可以通過電轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)移到受體菌中。pittii不動(dòng)桿菌、nosocomialis不動(dòng)桿菌和部分鮑曼不動(dòng)桿菌中攜帶blaOXA-58基因的質(zhì)粒具有相同的質(zhì)粒復(fù)制子分型，提示質(zhì)粒在不動(dòng)桿菌間的傳播也是造成鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐