水產(chǎn)品中危害物膠體金免疫層析毛細管檢測技術的研究.pdf

1、膠體金免疫層析技術是以膠體金作為示蹤標記物，基于抗原抗體特異性結(jié)合的一類快速檢測技術，具有操作方便、檢測快速、標記物穩(wěn)定、成本低、對檢測人員要求不高等優(yōu)點，廣泛應用于醫(yī)療診斷、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領域的定性和定量檢測。膠體金免疫層析技術的載體以硝酸纖維素膜(NC)為主，但由于其生產(chǎn)工藝復雜很難控制產(chǎn)品的結(jié)構差異;膜孔徑、樣品體系、點樣環(huán)境（溫度、濕度）、封閉情況、儲存條件等均對蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合產(chǎn)生影響;另外硝酸纖維素膜的材質(zhì)較脆在操作過

2、程中易碎、易折和產(chǎn)生劃痕等，因此檢測過程中易出現(xiàn)拖帶、顯色不均勻的現(xiàn)象致使免疫層析技術的靈敏度、穩(wěn)定性受到影響，檢測成本降低的空間較小。因此建立一種基底材質(zhì)穩(wěn)定、成本低廉、便于操作的免疫層析快速檢測方法為目前研究的熱點。
　　本文采用廉價易得、表面均一光滑、透光性好、耐高溫、耐高離子強度清洗的玻璃材質(zhì)作為載體，建立了一種以玻璃毛細管為基底，以膠體金為標記示蹤物，利用抗原抗體的特異性結(jié)合實現(xiàn)對目標物的檢測的新技術，并對其檢測性能進行

3、了分析，將免疫層析技術成功的轉(zhuǎn)移至毛細管中進行，命名為膠體金免疫層析毛細管（capillary immunochromatographic assay CICA）。論文的主要研究結(jié)果如下:
　　本論文首先利用檸檬酸鈉還原法制備了3種不同粒徑的膠體金粒子，在最優(yōu)條件下制備了膠體金標記抗體復合物。最終根據(jù)膠體金標記抗體復合物的穩(wěn)定性、抗原結(jié)合能力選擇13nm的膠體金粒子標記抗體制備免疫檢測探針用于后續(xù)的實驗。對清洗活化后的玻璃毛細管使

4、用γ-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）進行修飾，將包被原和二抗共價結(jié)合在毛細管的特定位置作為檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，組裝了新型的用于小清蛋白快速檢測的免疫層析毛細管。
　　對毛細管的修飾時間和檢測條件進行了優(yōu)化，利用最優(yōu)條件下制備的免疫層析毛細管實現(xiàn)對魚類的主要過敏原小清蛋白的檢測，其視覺檢測限為70ng mL-1，半定量檢測限為40 ng mL-1。對新建方法的檢測性能進行分析，并對多種實際樣品進行檢測，表明免疫層析毛細管具

5、有結(jié)構簡單、穩(wěn)定性、重復性和特異性好等優(yōu)點。
　　為驗證新建膠體金免疫層析毛細管的普遍適用性，研究其是否適合用于對靈敏度要求較高，樣品基質(zhì)更復雜的小分子物質(zhì)的檢測。參照免疫競爭的原理將呋喃唑酮代謝物的包被原(AOZ-OVA)和羊抗鼠二抗分別共價固定在修飾后的毛細管的特定區(qū)域為檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，對毛細管壁的非特異性結(jié)合位點封閉后便組裝成功了用于呋喃唑酮代謝物快速檢測的CICA。對毛細管的修飾方法和檢測方法進行了詳細的優(yōu)化，在最優(yōu)條件下

6、其視覺檢測限為0.65 ng mL-1，使用平板掃描儀進行半定量測試其檢測限為0.26 ng mL-1，包括樣品前處理的整個檢測過程在2h內(nèi)可以完成。該方法呈現(xiàn)出對小分子檢測優(yōu)異的靈敏度、重復性、選擇性，并成功用于多種實際樣品的檢測。
　　以玻璃材質(zhì)為基底為免疫層析檢測方法的再生提供了可能，也是降低生產(chǎn)成本提高檢測穩(wěn)定性、重復性和特異性的有效手段。首先優(yōu)選出適合免疫層析毛細管的解離液:含1％(v/v) DMSO和5％(w/v) S

7、DS的0.1M甘氨酸-鹽酸(pH2.8)緩沖液。對影響再生的條件進行優(yōu)化，得出最佳的解離條件為:顯色后60min內(nèi)進行解離，解離溫度為20℃，解離時間為5min。在最優(yōu)條件下用于呋喃唑酮代謝物檢測的免疫層析毛細管可再生3次，且再生后的靈敏度和穩(wěn)定性不受影響。
　　玻璃材料具有表面光滑、耐高溫、耐高離子強度清洗等優(yōu)點，但要將蛋白質(zhì)固定在其表面首先需要經(jīng)過修飾。本研究探討了玻璃毛細管表面經(jīng)過氨基、環(huán)氧基、醛基等基團的修飾方法。通過手臂

8、或樹枝狀大分子修飾的毛細管使固定其上的生物材料分子伸出基底有利于維持空間形態(tài)，更易于抗原抗體的結(jié)合，使免疫層析毛細管呈現(xiàn)出更優(yōu)異的穩(wěn)定性。修飾方法對靈敏度和再生性影響不大。優(yōu)選出最佳的儲存條件為4℃下于PBS液體中儲存。
　　本文以玻璃毛細管為基底成功組裝了CICA，并對其組建條件進行了詳細優(yōu)化。實現(xiàn)了對水產(chǎn)品中的大分子和靈敏度要求較高的小分子的檢測;對再生性能進行了研究，對適宜構建免疫層析毛細管的修飾方法進行探討。目前建立的免疫