苯甲酰甲腈水解酶產(chǎn)生菌的篩選及應(yīng)用研究.pdf

1、苯甲酰甲酸是一種重要的有機(jī)合成中間體,能夠廣泛地應(yīng)用于農(nóng)藥和醫(yī)藥等的合成。隨著科學(xué)和技術(shù)的發(fā)展,苯甲酰甲酸應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大,對(duì)其需求也逐年提高,其高效合成越來越引起許多專家學(xué)者的重視。利用苯甲酰甲腈水解酶可以實(shí)現(xiàn)苯甲酰甲酸的合成,該工藝反應(yīng)條件溫和,得到的產(chǎn)品質(zhì)量高,符合綠色化學(xué)的發(fā)展要求,具有廣闊的開發(fā)前景。本文旨在建立一種高通量的腈水解酶篩選方法,從自然界中篩選到高活性苯甲酰甲腈水解酶產(chǎn)生菌。進(jìn)一步優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)條件及催化反應(yīng)條件,

2、并擴(kuò)展底物譜最大限度的挖掘其作為生物催化劑的潛力。為了提高生物催化劑的穩(wěn)定性及重復(fù)利用率,采用海藻酸鈣包埋法進(jìn)行細(xì)胞固定化,考察固定化細(xì)胞的部分催化特性,最后對(duì)CCZU10-1催化苯甲酰甲腈的水解產(chǎn)物進(jìn)行分析。
　　首先,基于改進(jìn)的羥肟酸鐵比色法建立了腈水解酶高通量的篩選方法。優(yōu)化并確定了最適顯色反應(yīng)條件:0.5mLN,N-二環(huán)己基碳二亞胺(0.60mol·L-1)和1.0mL高氯酸羥胺(0.070mol·L-1)分別添加到50μ

3、L待測(cè)樣品中,混合均勻后在室溫(25℃~35℃)條件下恒溫反應(yīng)15min之后,0.7mL酸性氯化鐵(0.040mol·L-1)溶液立即加入到混合液中,在520nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。最終建立了一種簡(jiǎn)單、快速、高通量的腈水解酶篩選方法,同時(shí)對(duì)該方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證。并且通過與液相色譜法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果表明羥肟酸鐵比色法對(duì)有機(jī)羧酸的檢測(cè)具有較高的準(zhǔn)確性。
　　然后,依次以煙腈和苯甲酰甲腈為唯一氮源,通過富集培養(yǎng),從土壤中分離出一

4、株產(chǎn)高活性腈水解酶的菌株,通過對(duì)其形態(tài)特征觀察及生理生化鑒定,結(jié)合16SrDNA序列測(cè)定結(jié)果分析,最終確定目標(biāo)菌株菌為紅球菌屬(Rhodococcus),并將其命名為Rhodococcussp.CCZU10-1。
　　其次,對(duì)目標(biāo)菌株Rhodococcussp.CCZU10-1的產(chǎn)腈水解酶培養(yǎng)條件及催化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了最適培養(yǎng)條件:碳源為10g·L-1的葡萄糖,氮源為10g·L-1蛋白胨與5g·L-1酵母膏組合,以及在發(fā)酵

5、進(jìn)行24h時(shí)添加5mmol·L-1己內(nèi)酰胺作為誘導(dǎo)劑。此條件下腈水解酶活力為38.34U·mL-1。最適催化反應(yīng)條件為:反應(yīng)溫度為30℃,反應(yīng)pH為7.0,底物濃度為100mmol·L-1,助溶劑為甲苯(2％,v/v),金屬離子添加劑為Ca2+(0.1mmol·L-1)。在最適反應(yīng)條件下進(jìn)行催化反應(yīng),60h后苯甲酰甲酸產(chǎn)率最高可達(dá)98.22%。同時(shí),本研究考察了CCZU10-1腈水解酶對(duì)其它腈類化合物的降解情況,結(jié)果表明目標(biāo)菌株具有較寬

6、的底物譜。
　　最后,利用海藻酸鈣包埋法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定化,并考察了其部分催化特性,確定最適反應(yīng)條件:底物濃度150mmol·L-1,反應(yīng)溫度為35℃,反應(yīng)pH為7.0。對(duì)固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性研究結(jié)果表明,與游離細(xì)胞相比,固定化細(xì)胞能夠表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性,可以重復(fù)使用多次。并且,利用固定化細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng),產(chǎn)物易分離,操作簡(jiǎn)便。進(jìn)一步對(duì)固定化細(xì)胞催化水解苯甲酰甲腈獲得的產(chǎn)物苯甲酰甲酸進(jìn)行制備,最終通過高效液相色譜法及核磁共振分析確定產(chǎn)