利用龍須菜發(fā)酵乙醇的初步研究及發(fā)酵菌株的選育.pdf

1、本文以探索環(huán)保的海藻乙醇發(fā)酵條件為目的，對以龍須菜為原料發(fā)酵乙醇的酸解糊化、酶解發(fā)酵工藝進行研究。首先采用稀鹽酸對龍須菜進行酸解糊化以增大底物流動性，然后用瓊膠酶粗酶液進行酶解并探索了最佳酶解條件，最后通過對比酵母單菌發(fā)酵，混合菌發(fā)酵與分步酶解發(fā)酵三種處理效果，初步探索了以龍須菜為原料，生產(chǎn)生物乙醇的方法及可行性。同時，本文也嘗試利用原生質(zhì)體融合育種技術，篩選能夠以龍須菜為原料發(fā)酵乙醇的重組菌株。
　　在本實驗篩選到兩株瓊膠降解能

2、力較強的瓊膠降解菌QJ14和Hhjh，并進行16s rDNA分子鑒定，通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)QJ14與假交替單胞菌Pseudoalteromonasespejiana NCIMB2127(T)同源性高達100％，初步最終鑒定為Pseudomonadaceae sp.，Hhjh與白色噬瓊膠菌 Agarivorans albus MKT106(T)同源性高達99.9%，初步最終鑒定為 Agarivorans sp.。通過對這兩株菌進行

3、產(chǎn)酶條件優(yōu)化，菌株 QJ14的最高酶活達到75.26 U/ml，菌株Hhjh的最高酶活達到138.64 U/ml。
　　為了提高龍須菜的底物濃度，實驗探索了鹽酸濃度、酸解時間、酸解溫度對龍須菜酸解糊化的影響，證實了在鹽酸濃度為0.01 mol/L，121℃條件下反應10 min，就能獲得粘度適宜，流動性好的酸解糊化液。用QJ14和Hhjh產(chǎn)生的粗酶液酶解龍須菜酸解糊化液，通過優(yōu)化酶解條件，最高獲得29.33 mg/g還原糖產(chǎn)量。<

4、br>　　通過比較酵母單菌發(fā)酵，混合菌發(fā)酵與分步酶解發(fā)酵三種方法的效果，利用頂空氣相法（HS-GC法）檢測發(fā)酵液中乙醇產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)單菌發(fā)酵和混合菌發(fā)酵幾乎沒有乙醇產(chǎn)生，分步酶解發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量約為2.36 ml/L。
　　為了進一步簡化發(fā)酵工藝，縮短發(fā)酵時間，我們嘗試用原生質(zhì)體融合育種技術獲得能直接以龍須菜為底物，發(fā)酵生物乙醇的新菌株。探索了最佳原生質(zhì)體制備條件：假交替單胞菌QJ14培養(yǎng)4 h，以SMM為原生質(zhì)體滲透壓穩(wěn)定液，用0.5

5、 mg/ml的溶菌酶在30℃條件下，酶解40 min，原生質(zhì)體生成率*再生率達到9.84%；釀酒酵母用2%蝸牛酶培養(yǎng)8h，在37℃條件下，酶解40min，原生質(zhì)體生成率*再生率為13.92%。以45% PEG-4000為誘導劑，原生質(zhì)體數(shù)按酵母/QJ14為1/100的比例，在30℃下融合10min，4℃孵育60min。融合液涂布含150ug/ml氯霉素與10 ug/ml放線菌酮的篩選平板，連續(xù)觀察7天，未能獲得目的重組菌株，方法技術還有