鵝細(xì)小病毒安徽株的分離鑒定與組織分布.pdf

1、小鵝瘟是以雛鵝和雛番鴨作為侵染對(duì)象，以壞死性腸炎為主要病變的高度致死性傳染病，是危害中國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展的最嚴(yán)重傳染病之一。該病毒主要侵害10日齡以下的雛鵝，也偶有60日齡的鵝發(fā)病，發(fā)病率高達(dá)80％，致死率可達(dá)60%。因此，探討小鵝瘟病的流行規(guī)律、病毒在鵝體內(nèi)的復(fù)制及組織分布情況，對(duì)研究小鵝瘟的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。
　　研究分別從安徽兩個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病死亡的、具有小鵝瘟典型病變的病鵝肝臟病料中各分離獲得1株病毒，經(jīng)過電鏡觀察、PCR反應(yīng)、

2、全基因組序列分析鑒定后，證實(shí)分離株為鵝細(xì)小病毒(Gosling plague virus，GPV)，并分別命名為GPV YZ株和GPV WX株。通過將GPV YZ株和GPV WX株人工感染鵝胚發(fā)現(xiàn)，該兩株病毒均可引起鵝胚全身實(shí)質(zhì)性器官出血，部分鵝胚頭部皮下水腫。鵝胚致病性試驗(yàn)結(jié)果表明GPV YZ株的ELD50=10-4.840.2ml,GPV WX株的ELD50=10-5.160.2ml，兩株毒株的毒力相當(dāng)。設(shè)計(jì)5對(duì)引物進(jìn)行全基因擴(kuò)增，

3、測(cè)序結(jié)果表明YZ株和WX株全基因序列長(zhǎng)度均為5049bp，VP3片段長(zhǎng)度均為1605bp，兩毒株的全基因序列與VP3片段的核苷酸序列同源性分別為99.7%和99.4%。進(jìn)化樹分析表明此兩毒株與周邊省市分離的GPV毒株如江蘇GPV YZ99-6和LH株、上海GPV SHFX-1201株以及安徽GPV Y株等親緣關(guān)系較近；與標(biāo)準(zhǔn)毒株B株比較發(fā)現(xiàn)，YZ株和WX株均在67-80nt(CACATGCTTCCGGT)處、334-347nt(GCAT

4、GTGACCGGAA)處、4767-4780nt(CACATGCTTCCGGT)處、5033nt-5046nt(GCATGTGACCGGAA)處各缺少14個(gè)堿基，缺失部分均在ITR區(qū)，但并未影響病毒發(fā)夾結(jié)構(gòu)的生成。
　　為探索GPV在雛鵝體內(nèi)的增殖規(guī)律，研究選取GPV YZ株作為抗原建立GPV人工感染動(dòng)物模型；利用VP3片段設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立了SYBR Green I熒光定量PCR的檢測(cè)方法。通過構(gòu)建質(zhì)粒作為模板標(biāo)準(zhǔn)品繪制

5、出熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99表明Ct值與拷貝數(shù)對(duì)數(shù)之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，并得出函數(shù)公式：Y=-4.787X+35.44。應(yīng)用SYBR Green I熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)人工感染雛鵝各臟器在不同時(shí)間段的病毒含量。結(jié)果，48h以前病毒含量普遍較低，48h-96h病毒大量增殖，96h各臟器的病毒含量普遍達(dá)到最高水平，144h病毒含量下降，但比72h病毒含量高。因此得出GPV在雛鵝體內(nèi)增殖情況的數(shù)學(xué)模型是以96h為中軸的正態(tài)分布

6、曲線。以96h為例，各臟器的病毒含量為：腎臟＞回腸＞十二指腸＞脾臟＞空腸＞肝臟＞心臟＞大腦。
　　為揭示GPV的抗原定位和引起的組織學(xué)變化，研究以人工感染雛鵝96h時(shí)的各臟器作為檢測(cè)對(duì)象，通過免疫組化和HE染色技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，HE染色結(jié)果顯示GPV引起小腸絨毛脫落、腎小管上皮細(xì)胞腫脹、肝臟出血等，免疫組化結(jié)果顯示病毒抗原定位于小腸絨毛上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、大腦神經(jīng)細(xì)胞的胞漿中，其中小腸、腎臟所檢測(cè)到的陽性信號(hào)比肝臟等實(shí)質(zhì)性臟器的