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文檔簡介
1、小鵝瘟是以雛鵝和雛番鴨作為侵染對象,以壞死性腸炎為主要病變的高度致死性傳染病,是危害中國養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展的最嚴重傳染病之一。該病毒主要侵害10日齡以下的雛鵝,也偶有60日齡的鵝發(fā)病,發(fā)病率高達80%,致死率可達60%。因此,探討小鵝瘟病的流行規(guī)律、病毒在鵝體內(nèi)的復制及組織分布情況,對研究小鵝瘟的發(fā)病機制具有重要意義。
研究分別從安徽兩個養(yǎng)殖場發(fā)病死亡的、具有小鵝瘟典型病變的病鵝肝臟病料中各分離獲得1株病毒,經(jīng)過電鏡觀察、PCR反應、
2、全基因組序列分析鑒定后,證實分離株為鵝細小病毒(Gosling plague virus,GPV),并分別命名為GPV YZ株和GPV WX株。通過將GPV YZ株和GPV WX株人工感染鵝胚發(fā)現(xiàn),該兩株病毒均可引起鵝胚全身實質(zhì)性器官出血,部分鵝胚頭部皮下水腫。鵝胚致病性試驗結(jié)果表明GPV YZ株的ELD50=10-4.840.2ml,GPV WX株的ELD50=10-5.160.2ml,兩株毒株的毒力相當。設計5對引物進行全基因擴增,
3、測序結(jié)果表明YZ株和WX株全基因序列長度均為5049bp,VP3片段長度均為1605bp,兩毒株的全基因序列與VP3片段的核苷酸序列同源性分別為99.7%和99.4%。進化樹分析表明此兩毒株與周邊省市分離的GPV毒株如江蘇GPV YZ99-6和LH株、上海GPV SHFX-1201株以及安徽GPV Y株等親緣關系較近;與標準毒株B株比較發(fā)現(xiàn),YZ株和WX株均在67-80nt(CACATGCTTCCGGT)處、334-347nt(GCAT
4、GTGACCGGAA)處、4767-4780nt(CACATGCTTCCGGT)處、5033nt-5046nt(GCATGTGACCGGAA)處各缺少14個堿基,缺失部分均在ITR區(qū),但并未影響病毒發(fā)夾結(jié)構(gòu)的生成。
為探索GPV在雛鵝體內(nèi)的增殖規(guī)律,研究選取GPV YZ株作為抗原建立GPV人工感染動物模型;利用VP3片段設計了一對特異性引物,建立了SYBR Green I熒光定量PCR的檢測方法。通過構(gòu)建質(zhì)粒作為模板標準品繪制
5、出熒光標準曲線,相關系數(shù)R2≥0.99表明Ct值與拷貝數(shù)對數(shù)之間呈現(xiàn)出良好的線性關系,并得出函數(shù)公式:Y=-4.787X+35.44。應用SYBR Green I熒光定量PCR技術檢測人工感染雛鵝各臟器在不同時間段的病毒含量。結(jié)果,48h以前病毒含量普遍較低,48h-96h病毒大量增殖,96h各臟器的病毒含量普遍達到最高水平,144h病毒含量下降,但比72h病毒含量高。因此得出GPV在雛鵝體內(nèi)增殖情況的數(shù)學模型是以96h為中軸的正態(tài)分布
6、曲線。以96h為例,各臟器的病毒含量為:腎臟>回腸>十二指腸>脾臟>空腸>肝臟>心臟>大腦。
為揭示GPV的抗原定位和引起的組織學變化,研究以人工感染雛鵝96h時的各臟器作為檢測對象,通過免疫組化和HE染色技術進行檢測,HE染色結(jié)果顯示GPV引起小腸絨毛脫落、腎小管上皮細胞腫脹、肝臟出血等,免疫組化結(jié)果顯示病毒抗原定位于小腸絨毛上皮細胞、腎小管上皮細胞、大腦神經(jīng)細胞的胞漿中,其中小腸、腎臟所檢測到的陽性信號比肝臟等實質(zhì)性臟器的
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