免疫組化和PCR方法檢測(cè)鵝細(xì)小病毒在感染雛鵝體內(nèi)分布規(guī)律研究.pdf

1、本研究通過對(duì)免疫組化方法部分條件進(jìn)行優(yōu)化，其中包括，3％H2O2孵育時(shí)間和濃度、抗原修復(fù)的方法、抗體稀釋度及孵育時(shí)間的優(yōu)化，成功建立了檢測(cè)鵝細(xì)小病毒(GPV)在14日齡雛鵝體內(nèi)分布的間接免疫酶組織化學(xué)染色法。經(jīng)替代試驗(yàn)和陽性、陰性對(duì)照試驗(yàn)表明該法具有敏感性高和特異性好的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)參照GenBank中發(fā)表的GPV基因組序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件oligo6.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增GPVNS2基因所用的一對(duì)引物，應(yīng)用這對(duì)引物對(duì)感染細(xì)小病毒雛鵝組織抽提的病毒

2、DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了與設(shè)計(jì)大小相符合的特異性條帶，成功地建立了檢測(cè)鵝細(xì)小病毒在感染雛鵝體內(nèi)分布的PCR方法。 本文結(jié)合免疫組化方法能夠?qū)Σ《究乖M(jìn)行定位和PCR方法敏感、特異的特點(diǎn)，對(duì)14日齡雛鵝感染GPV后，不同時(shí)間病毒抗原在體內(nèi)的定位及分布情況進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用圖像分析軟件對(duì)主要組織的抗原染色強(qiáng)度進(jìn)行了定量分析。檢測(cè)結(jié)果表明： 感染后第1d即能在心臟、肺臟、脾臟、法氏囊、胸腺、腺胃、十二指腸、空腸、回腸和血液中檢

3、測(cè)到GPV存在；感染后第3d檢測(cè)剛性組織開始增多，除上述組織外還能在肝臟和盲腸中檢測(cè)到病毒抗原；感染后第4d開始能從大腦、糞便和肛門棉拭子中檢測(cè)到病毒；感染后第5d可從食管中檢測(cè)出GPV。此時(shí)感染組織最廣泛，組織的損傷程度也最火；感染后第6d陽性組織開始減少，肝臟和肛門棉拭子中檢測(cè)不出GPV存在；感染后第7d，肝臟、盲腸、糞便和血液中檢測(cè)不出GPV存在；感染后第14d僅能在空腸、胸腺和食管中檢測(cè)到GPV存在；感染后第21d，僅能在空腸中

4、檢測(cè)到病毒抗原。在整個(gè)檢測(cè)過程中始終未能從胰腺和骨骼肌檢測(cè)到GPV。 免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明，病毒抗原廣泛分布于肝細(xì)胞、腸道上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞，肺泡壁細(xì)胞和腎小管的上皮細(xì)胞內(nèi)；可見上皮細(xì)胞為GPV的主要靶細(xì)胞并且GPV主要分布在細(xì)胞核內(nèi)。通過對(duì)免疫組化陽性組織的抗原強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)感染后4～6d染色強(qiáng)度最為強(qiáng)烈。尤其腸道中的空腸抗原強(qiáng)度最高。對(duì)脾臟、胸腺和法氏囊的抗原強(qiáng)度比較分析，胸腺在免疫組織中抗原強(qiáng)度最高，表明雛鵝受到