家蠶細(xì)小病毒樣病毒(中國鎮(zhèn)江株)結(jié)構(gòu)蛋白的鑒定與解析.pdf

1、家蠶細(xì)小病毒樣病毒Bombyx mori parvo-like virus(BmPLV)感染家蠶，并引發(fā)軟化病。該病毒是造成夏秋季蠶繭減產(chǎn)的主要病原之一。BmPLV過去稱為家蠶濃核病毒2型(BmDNV-2)。BmPLV無囊膜，衣殼呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)。BmPLV與細(xì)小病毒比較有兩個(gè)顯著的特征：一是該病毒的基因組為兩個(gè)單鏈DNA分子(VD1，VD2)，并且這兩個(gè)分子獨(dú)立包裝在不同衣殼中；二是基因組具有編碼DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)域。病毒兩部分基因

2、組分別包裝在不同衣殼中，這種特性在動(dòng)物病毒中尚為首例。病毒結(jié)構(gòu)蛋白的性質(zhì)和組成決定了病毒衣殼結(jié)構(gòu)及病毒粒子侵染特性。目前，家蠶細(xì)小病毒樣病毒的結(jié)構(gòu)蛋白性質(zhì)和組成尚未確定。
　　 本研究中，首先克隆了家蠶細(xì)小病毒樣病毒(中國鎮(zhèn)江株)vp基因，在大腸桿菌中進(jìn)行了融合表達(dá)，制備VP蛋白多克隆抗體；其次，通過氯化銫密度梯度超速離心，對(duì)病蠶蠶糞中的病毒粒子進(jìn)行純化，由SDS-PAGE電泳對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行分析，并應(yīng)用Western bol

3、t和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)病毒的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行鑒定。最后，對(duì)病毒vp基因進(jìn)行真核表達(dá)。取得的研究成果如下：
　　 1.原核表達(dá)病毒VP蛋白，制備多克隆抗體
　　 克隆vp基因，構(gòu)建了具有麥芽糖標(biāo)簽的重組表達(dá)載體pMAL-c2x-vp。在大腸桿菌E.coli TB1菌株中，經(jīng)終濃度1.0 mmol/L IPTG37℃誘導(dǎo)，表達(dá)融合蛋白MBP-VP。通過12％的SDS-PAGE電泳分析，在97.2 kDa的位置有特異條帶。這與融合蛋白MB

4、P-VP的理論分子量97.5 kDa基本一致。對(duì)特異蛋白條帶的質(zhì)譜鑒定，證明vp基因在大腸桿菌中進(jìn)行了融合表達(dá)。用MBP-VP融合蛋白免疫大白兔，獲得MBP-VP蛋白的抗血清，并經(jīng)過蛋白A親和層析柱純化，獲得了MBP-VP多克隆抗體。
　　 2.家蠶細(xì)小病毒樣病毒(中國鎮(zhèn)江株)結(jié)構(gòu)蛋白的鑒定
　　 對(duì)病蠶蠶糞中的病毒粒子進(jìn)行氯化銫密度梯度超速離心純化，經(jīng)透射電鏡觀察，病毒粒子純度較高。病毒粒子經(jīng)100℃高溫變性，并通過1

5、0％的SDS-PAGE電泳分析，膠上顯示主要有7條蛋白帶，分別命名為P1-P7。分子量分布在32-133 kDa之間。對(duì)膠上的蛋白分別用VP蛋白抗體和病毒粒子抗血清進(jìn)行Western blot鑒定以及質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明：P5，P6是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由VD1-ORF3編碼。P7是病毒的次要結(jié)構(gòu)蛋白，由VD2-ORF1編碼。
　　 3.在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)病毒VP蛋白
　　 將vp基因連接到轉(zhuǎn)移載體pFastBacHT