N-磷酸化修飾研究——磷酰胺鹽的制備及pArg抗體應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)有諸多翻譯后修飾(post-translational modifications，PTMs)，包括甲基化、泛素化、乙?；土姿峄鹊取Ｆ渲?，磷酸化修飾被認(rèn)為是調(diào)控蛋白質(zhì)功能的重要“開關(guān)”，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵機(jī)制，與人類多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前，天然蛋白質(zhì)中共發(fā)現(xiàn)有9種氨基酸可以被磷酸化，其中包括以P-O鍵連接的磷酸酯類修飾，如磷酸化絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸;以P-N鍵連接的磷酰胺類修飾，如磷酸化組氨酸、精氨酸和賴氨酸;酰基

2、酸化是通過天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的，而S-磷酸化則通過半胱氨酸磷酸化形成的。蛋白質(zhì)N-磷酸化比O-磷酸化約早20年被發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)表明，在真核生物細(xì)胞核內(nèi)就存在約6％的磷酸化組氨酸(pHis)修飾。據(jù)推測(cè)這些蛋白的N-磷酸化修飾參與了核小體組裝、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等核心的生命過程。由于N-磷酸化修飾中P-N鍵的高反應(yīng)活性，該修飾相比于O-磷酸化的研究進(jìn)展緩慢。近年來隨著抗體制備技術(shù)及質(zhì)譜分析技術(shù)的發(fā)展，國(guó)際上首次制備出識(shí)別pHis

3、的多克隆抗體，并發(fā)現(xiàn)了磷酸化組氨酸在質(zhì)譜中存在特異的裂解規(guī)律，以及首個(gè)磷酸化精氨酸（pArg）激酶的發(fā)現(xiàn)與鑒定等突破性進(jìn)展，都為該領(lǐng)域的研究做出了卓越的貢獻(xiàn)。
　　為了深入對(duì)P-N鍵領(lǐng)域的研究，并基于本課題組長(zhǎng)期以來致力于磷化學(xué)的研究基礎(chǔ)，課題組擬建立以抗pHis和pArg的抗體為主要研究工具的蛋白質(zhì)組學(xué)大方向。因此，在本論文中，主要開展了以下兩個(gè)方面的研究：
　　一、構(gòu)建便捷、高效制備磷酰胺鈉鹽的新方法。為了制備特異性識(shí)別

4、pHis的單克隆抗體，需要大量的含pHis的蛋白作為真實(shí)抗原進(jìn)行篩選，因此要發(fā)展一種可以高效、便捷地制備含pHis的蛋白的方法?；谝延械难芯靠芍?，磷酰胺鹽可以用于組氨酸的磷酸化，為此，開發(fā)了一條以偏三聚磷酸鈉(Sodiumtrimetaphosphate，P3m)為原料，綠色、高效、便捷地制備磷酰胺鈉鹽的新方法，對(duì)磷酰胺鹽的制備產(chǎn)率可以高達(dá)86％，而傳統(tǒng)的方法僅為33％，并將用該方法合成出的磷酰胺鈉鹽（Sodium Phosphora

5、midate，SPA）分別用于小分子組氨酸、含組氨酸肽段、含組氨酸蛋白的磷酸化修飾，并對(duì)反應(yīng)的條件、效率、機(jī)理等進(jìn)行核磁或者質(zhì)譜的跟蹤及表征，建立了一套系統(tǒng)的，可以快速制備含pHis蛋白的新方法，為后續(xù)針對(duì)pHis的研究提供了豐富的實(shí)驗(yàn)和技術(shù)支持。
　　二、真核體系內(nèi)尋找并鑒定含pArg修飾蛋白的方法建立?；诜€(wěn)定類似物設(shè)計(jì)，課題組成功獲得可以特異性識(shí)別pArg的鼠和兔的多克隆抗體。由于鼠血清有限，故本論文工作以兔血清為研究工具，

6、通過對(duì)原核體系的免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兔多克隆抗體具有較高的活性，可以用于WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pArg蛋白;利用兔多克隆抗體首先對(duì)真核細(xì)胞株進(jìn)行篩選，選定了293T和Jurkat為真核研究體系;以此抗體為基礎(chǔ)，發(fā)展了一種親和純化抗體的方法，可以高效地純化出特異性高的抗體組分;利用純化后的抗體對(duì)真核細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀及印跡以及酶切質(zhì)譜的鑒定。目前，基于pArg多抗的富集、篩選技術(shù)仍在進(jìn)一步優(yōu)化完善中。本論文的相關(guān)研究工作將為后續(xù)真核體系內(nèi)pArg