磷酸化修飾對HSF4b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控.pdf

1、背景：白內(nèi)障是由于眼球晶狀體的部分或全部渾濁化所導(dǎo)致的視力下降?？煞譃樵绨l(fā)型(先天性)白內(nèi)障和遺傳性白內(nèi)障。先天性白內(nèi)障是指出生后一年內(nèi)出現(xiàn)的晶狀體渾濁,是兒童視力喪失的主要原因之一。先天性白內(nèi)障的遺傳方式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖隱性遺傳等,其中以常染色體顯性遺傳性先天性白內(nèi)障(ADCC)為主。
　　到目前為止,通過對一系列ADCC家族進(jìn)行基因連鎖分析,對先天性白內(nèi)障的遺傳背景有了更加詳細(xì)的了解,約有40多個遺

2、傳位點(diǎn)和常染色體顯性先天性白內(nèi)障有關(guān),按照其編碼蛋白功能,與人類ADCC有關(guān)的基因分一下四類:晶狀體蛋白基因,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因,細(xì)胞骨架蛋白基因和膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。其中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因中的HSF4有很重要的作用,對其研究亦有所進(jìn)步,它在晶狀體纖維細(xì)胞的生長和成熟等過程中起著重要作用,但是其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制還不清楚。近年來發(fā)現(xiàn)與白內(nèi)障有關(guān)的突變位點(diǎn)的數(shù)量已超過100個。在人體內(nèi),通過對一系列ADCC家族進(jìn)行基因連鎖分析發(fā)現(xiàn)均存在HSF4b基因

3、的錯義突變。在小鼠,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)敲除小鼠的HSF4基因,新生小鼠出生后3-5天即出現(xiàn)白內(nèi)障,可能與晶狀體纖維細(xì)胞分化和發(fā)育異常有關(guān)。
　　HSF4是HSFs即熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族的一個成員,它在外界和內(nèi)環(huán)境等的刺激或者正常生理狀態(tài)下都可形成三聚體,然后和熱休克元件(HSE)結(jié)合,激活下游HSP27、HSP70、HSP90以及晶狀體蛋白等的表達(dá)。HSF4分兩不同亞型:HSF4a和HSF4b。前者有轉(zhuǎn)錄抑制活性,而后者具有轉(zhuǎn)錄激活和抑

4、制雙重作用。HSF4b是晶狀體內(nèi)特異表達(dá)的亞型。小鼠晶狀體HSF4b的缺失降低Hsp25,γ-crystallin和CP49等蛋白的表達(dá)。
　　磷酸化是蛋白質(zhì)最重要的翻譯后修飾之一,在細(xì)胞信號的傳遞過程中占有極其重要的地位,HSF4b在生理?xiàng)l件下即可處于磷酸化狀態(tài),也可以受MAP激酶調(diào)控發(fā)生磷酸化修飾,即HSF4b受P38、JNK和ERKl/2的磷酸化調(diào)控發(fā)生磷酸化,磷酸化后激活其下游熱休克蛋白表達(dá),磷酸化可誘導(dǎo)HSF4b類泛素化

5、,SUM0反過來抑制了HSF4b體外轉(zhuǎn)錄活性。HSF4中含有一個PDSM(磷酸化依賴SUMO化修飾基序)模體,PDSM存在于保守兩個功能不同的熱休克因子家族成員HSF1和HSF4b中間,與SUMO相似,PDSM通過磷酸化依賴SUMO化,發(fā)過來抑制了底物的轉(zhuǎn)錄活性。HSF4b中的S299絲氨酸處于PDSM模體PASP中,因此我們推測該位點(diǎn)磷酸化后能反過來抑制HSF4b的轉(zhuǎn)錄活性。
　　14-3-3與靶蛋白結(jié)合時主要通過識別靶蛋白中的

6、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸識別序列。根據(jù)這些序列模體可以推測某些蛋白質(zhì)能否和14-3-3蛋白結(jié)合,S299位點(diǎn)存在含有絲氨酸的模體,我們猜測它是否與14-3-3相互作用。下一步實(shí)驗(yàn)既是利用三個突變體分別與14-3-3共轉(zhuǎn)染觀察它們的結(jié)合作用,結(jié)合下游蛋白的表達(dá)量來分析該位點(diǎn)磷酸化后對HSF4b的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)。
　　為了進(jìn)一步了解控制HSF4b轉(zhuǎn)錄活性的分子機(jī)制,我們就磷酸化調(diào)控HSF4b的機(jī)制進(jìn)行探討,預(yù)測可能的蛋白序列磷酸化位點(diǎn),將其

7、定點(diǎn)突變進(jìn)行功能研究和機(jī)制研究,找到相應(yīng)的磷酸化激酶和通路。
　　本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建HSF4b的突變體,測定HSF4b的轉(zhuǎn)錄活性,確定有效的磷酸化位點(diǎn)以及對下游相關(guān)基因的調(diào)控。
　　目的：
　　本研究通過構(gòu)建HSF4b的突變體,測定HSF4b的轉(zhuǎn)錄活性,確定有效的磷酸化位點(diǎn)以及HSF4b下游相關(guān)基因的調(diào)控。
　　方法：
　　1.應(yīng)用PCR技術(shù),利用突變引物擴(kuò)增PWZL-blast-HSF4b(以下簡稱HSF4b

8、),產(chǎn)物用DpnⅠ酶切,轉(zhuǎn)化至DH5α中,提取質(zhì)粒,ECORⅠ初步酶切鑒定,測序。
　　2.測序證確后,將上述突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進(jìn)行真核表達(dá)。利用SDS-PAGE和Western blot實(shí)驗(yàn)鑒定HSF4b和Hsp27蛋白的表達(dá),初步確定有效的磷酸化位點(diǎn)。
　　3.利用HSF4b缺失的晶狀體上皮細(xì)胞(MLEC-/-),轉(zhuǎn)染突變體質(zhì)粒,建立穩(wěn)定株MLEC HSF4b、MLEC HSF4b/S299A、MLEC HSF4

9、b/S299D和MLEC HSF4b/S299E。Western blot實(shí)驗(yàn)鑒定HSF4b和Hsp27,alpha B-crystallin等蛋白的表達(dá)。
　　4.通過luciferase assay實(shí)驗(yàn),來驗(yàn)證HSF4b/S299A,HSF4b/S299D, HSF4b/S299E對下游基因αB-晶體蛋白(alpha B-crystallin)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建了HSF4b的突變質(zhì)粒HSF4b/S4

10、2A、HSF4b/S49A、HSF4b/S66A、HSF4b/S85A、HSF4b/T173A、HSF4b/T221A、HSF4b/S243A、HSF4b/S269A、HSF4b/S278A、HSF4b/S299A、HSF4b/S340A、HSF4b/S372A、HSF4b/S401A、HSF4b/T446A、HSF4b/T471A、HSF4b/S489A、HSF4b/S299D和HSF4b/S299E共18個,測序正確。
　　2

11、.將上述突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,Western blot實(shí)驗(yàn)鑒定體內(nèi)Hsp27蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示:HSF4b/S66、AHSF4b/S269A、HSF4b/T446A、HSF4b/T471A的Hsp27表達(dá)降低,HSF4b/S299A的Hsp27表達(dá)升高,其他突變體無明顯變化。
　　3.成功建立了穩(wěn)定株MLEC/HSF4b、MLEC/HSF4b/S299A、MLEC/HSF4b/S299D和MLEC/HSF4b/S299E三個,

12、Western blot實(shí)驗(yàn)證明S299是有效的磷酸化位點(diǎn),起到了表達(dá)抑制作用。
　　4. Luciferase assay說明了S299A對HSF4b下游αB-晶體蛋白(alpha B-crystallin)有轉(zhuǎn)錄激活作用,HSF4b/S299D和HSF4b/S299E對HSF4b下游基因alpha B-crystallin有轉(zhuǎn)錄抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了HSF4b表達(dá)突變體18個。
　　2.初