TSH調(diào)節(jié)肝臟HMg-CoA還原酶磷酸化修飾的研究.pdf

1、研究背景:
　　膽固醇是動物組織細(xì)胞所不可缺少的重要物質(zhì)，它不僅參與形成細(xì)胞膜，而且是合成膽汁酸，維生素D以及甾體激素的原料，對于細(xì)胞膜完整性的維持和體內(nèi)生命活動都具有重要的意義，但體內(nèi)膽固醇過多會導(dǎo)致高膽固醇血癥，對機(jī)體產(chǎn)生不利的影響。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化、靜脈血栓形成、膽石癥與高膽固醇血癥密切相關(guān)。
　　3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，

2、HMG-CoA)還原酶(HMGCR)位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，它催化由HMG-CoA還原成甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)的反應(yīng)是整個膽固醇合成途徑的限速反應(yīng)，HMGCR則是膽固醇合成的限速酶。通過調(diào)節(jié)該酶的活性可維持體內(nèi)膽固醇的穩(wěn)定。HMGCR在肝臟高水平表達(dá)，肝臟在調(diào)節(jié)機(jī)體膽固醇代謝方面發(fā)揮中心的作用已成共識。HMGCR在多個水平上受到調(diào)節(jié)，包括轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、酶的降解、磷酸化/去磷酸化修飾和產(chǎn)物反饋抑制等。研究發(fā)現(xiàn)，HMGCR

3、的磷酸化/去磷酸化修飾在調(diào)節(jié)膽固醇合成中發(fā)揮了重要作用。HMGCR在細(xì)胞液中經(jīng)蛋白激酶催化發(fā)生磷酸化喪失活性，而在磷蛋白磷酸酶作用下又可以脫去磷酸從而恢復(fù)酶活性。有研究表明，AMPK是肝臟中磷酸化HMGCR的主要激酶，它可以磷酸化HMGCR871位點的絲氨酸從而抑制該酶的活性。
　　臨床上發(fā)現(xiàn)，亞臨床甲狀腺功能減退癥的患者，血清促甲狀腺素(thyrotropin or thyroid stimulating hormone，TSH

4、)水平升高而甲狀腺激素水平正常，測血脂譜發(fā)現(xiàn)血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)水平增高而高密度脂蛋白(HDL)降低。一些大型流行病學(xué)調(diào)查研究也發(fā)現(xiàn)在亞臨床甲減時TSH與TC相關(guān)。例如，Turha報道在亞臨床甲狀腺功能減退時血清TSH與TC有明顯相關(guān)性(r=0.52;p=0.001)。說明TSH與血清膽固醇升高有一定聯(lián)系。
　　促甲狀腺素受體(thyrotropin receptor, TSHR)是人體內(nèi)介導(dǎo)TSH調(diào)控功能

5、的重要的蛋白分子。大量研究表明，TSHR不僅在甲狀腺細(xì)胞表面表達(dá)，而且廣泛表達(dá)于非甲狀腺組織細(xì)胞內(nèi)，如脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等，且在這些細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的病理生理作用。研究已證實，肝臟作為機(jī)體內(nèi)最重要的組織器官之一，在肝細(xì)胞表面亦有功能性的TSHR的表達(dá)并且TSH可通過cAMP/PKA/CREB信號通路促進(jìn)肝臟HMGCR表達(dá)，增加肝臟膽固醇的合成，而TSH是否對HMGCR的磷酸化/去磷酸化修飾有影響尚未見報道。<

6、br>　　研究目的:
　　1、TSH是否對肝臟HMGCR磷酸化修飾有影響。
　　2、探討TSH調(diào)節(jié)肝臟HMGCR磷酸化修飾中的可能機(jī)制，觀察PKA、AMPK在其中的作用。
　　研究方法:
　　1、為了研究TSH是否對肝臟HMGCR磷酸化修飾有影響，實驗用不同濃度的牛TSH(bTSH)刺激小鼠肝臟原代細(xì)胞及人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，檢測p-HMGCR及HMGCR的蛋白表達(dá)。
　　2、為了研究TSH是否對肝臟

7、AMPK有影響，實驗用不同濃度的bTSH刺激小鼠肝臟原代細(xì)胞及人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，檢測p-AMPK及AMPK的蛋白表達(dá)。
　　3、為了探討TSH降低肝細(xì)胞HMGCR磷酸化表達(dá)是否通過調(diào)節(jié)AMPK的活化來實現(xiàn)，HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染持續(xù)激活A(yù)MPK質(zhì)粒(CA-AMPK)，再用bTSH刺激肝細(xì)胞，檢測p-HMGCR和HMGCR蛋白表達(dá)的變化。
　　4、為了探討PKA在TSH降低肝細(xì)胞AMPK及HMGCR磷酸化表達(dá)中的作用，用

8、PKA抑制劑H89預(yù)孵HepG2細(xì)胞，再用bTSH刺激肝細(xì)胞，檢測p-HMGCR、HMGCR、p-AMPK及AMPK的表達(dá)變化。
　　5、建立亞臨床甲減小鼠模型，檢測血清中膽固醇的變化，并檢測肝臟中p-HMGCR、HMGCR、p-AMPK及AMPK的表達(dá)變化。
　　6、建立Tshr-KO小鼠動物模型，檢測肝臟p-HMGCR、HMGCR、p-AMPK、AMPK的表達(dá)變化，探討TSH是否通過TSHR調(diào)節(jié)HMG-CoA還原酶的磷酸

9、化修飾。
　　研究結(jié)果:
　　1、TSH降低肝細(xì)胞HMGCR磷酸化表達(dá)
　　(1)與對照組相比，1μM、4μM bTSH處理小鼠肝臟原代細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)p-HMGCR蛋白表達(dá)均降低，而HMGCR的蛋白表達(dá)增加，并且p-HMGCR/HMGCR比值均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。說明bTSH可劑量依賴性地降低HMGCR磷酸化水平。
　　(2)與小鼠肝臟原代細(xì)胞相似，與對照組相比，1μM、4μM bTSH處理He

10、pG2細(xì)胞，Wester blotting示細(xì)胞內(nèi)p-HMGCR蛋白水平及p-HMGCR/HMGCR比值均呈劑量依賴性降低。
　　2、TSH通過抑制肝臟AMPK活化降低HMGCR磷酸化
　　(1)與對照組相比，1μM、4μM bTSH處理小鼠肝臟原代細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)p-AMPK蛋白表達(dá)均降低(p＜0.05），而AMPK的蛋白表達(dá)無明顯變化。說明bTSH可劑量依賴性地降低AMPK的活化水平。
　　(2)與小鼠肝臟原代細(xì)胞相似

11、，與對照組相比，1μM、4μM bTSH處理HepG2細(xì)胞，Wester blotting示細(xì)胞內(nèi)p-AMPK蛋白水平亦呈劑量依賴性降低。
　　(3)轉(zhuǎn)染CA-AMPK質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞，再給予bTSH刺激48小時。我們發(fā)現(xiàn)，持續(xù)激活A(yù)MPK能顯著抵抗TSH誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)p-HMGCR/HMGCR，p-AMPK/AMPK比值降低(P＜0.05)。未轉(zhuǎn)染CA-AMPK預(yù)處理的HepG2細(xì)胞，在TSH刺激48小時后p-HMGCR/HM

12、GCR，p-AMPK/AMPK比值明顯降低，但是轉(zhuǎn)染CA-AMPK后，再給予TSH刺激，p-HMGCR/HMGCR，p-AMPK/AMPK比值與僅給予TSH刺激組降低水平明顯減少。
　　3、 TSH通過PKA降低AMPK的活化及HMGCR的磷酸化
　　用H89預(yù)孵HepG2細(xì)胞1小時，再給予bTSH刺激細(xì)胞48小時。我們發(fā)現(xiàn)，H89能顯著抵抗TSH誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)p-HMGCR/HMGCR, p-AMPK/AMPK比值的降低(P

13、＜0.05)。無H89預(yù)處理的HepG2細(xì)胞，在bTSH刺激48小時后p-HMGCR/HMGCR，p-AMPK/AMPK比值明顯降低，但是H89處理后的細(xì)胞，在bTSH刺激后，p-HMGCR/HMGCR，p-AMPK/AMPK比值的降低明顯減少。
　　4、亞臨床甲減小鼠肝臟中HMGCR的磷酸化明顯降低
　　(1)與對照組相比，亞臨床甲減小鼠血清TSH水平明顯增加(P＜0.05)，但FT3沒有明顯變化(P＞0.05)，符合臨床

14、上對于亞臨床甲狀腺功能減退癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。亞臨床甲減小鼠血清膽固醇水平明顯升高(P＜0.05)。
　　(2)與對照組相比，亞臨床甲減小鼠肝臟HMGCR表達(dá)明顯增加，而p-HMGCR的表達(dá)明顯降低，p-HMGCR/HMGCR比值明顯降低(P＜0.05)。
　　(3)與對照組相比，亞臨床甲減小鼠肝臟p-AMPK表達(dá)明顯降低，而AMPK的表達(dá)無明顯變化，AMPK的磷酸化明顯降低(P＜0.05)。
　　5、TSH通過TSHR調(diào)節(jié)

15、肝臟HMGCR磷酸化
　　(1)與同窩野生型小鼠相比較，Tshr-KO小鼠血清FT4、TT4、TSH均沒有明顯變化(P＞0.05)，但血清膽固醇明顯降低(P＜0.05)。
　　(2)與同窩野生型小鼠相比較，Tshr-KO小鼠肝臟p-AMPK/AMPK，p-HMGCR/HMGCR比值明顯升高(P＜0.05)，p-HMGCR蛋白表達(dá)明顯增加。
　　結(jié)論:
　　TSH通過TSHR激活PKA，抑制肝臟AMPK的活化，從而