2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、括約肌功能障礙(ISD)是壓力性尿失禁(SUI)的主要原因,現(xiàn)有的治療方法包括手術(shù)治療和非手術(shù)治療,但這些方法僅改變了盆底解剖結(jié)構(gòu),均不能糾正ISD,不能從本質(zhì)上恢復(fù)患者的括約肌功能。鑒于近年來(lái)運(yùn)用干細(xì)胞移植修復(fù)肌肉損傷、改善肌肉收縮功能的報(bào)道,人們對(duì)干細(xì)胞移植治療SUI 寄予厚望。然而至今為止該療法并沒(méi)有獲得預(yù)期的療效,究其原因是由于干細(xì)胞移植后既往的研究?jī)H關(guān)注了移植后細(xì)胞表型的變化,對(duì)其在體內(nèi)外分化的機(jī)制研究甚少,導(dǎo)致人們不能很好的

2、運(yùn)用其分化的能力達(dá)到治療疾病的目的,因此研究干細(xì)胞在體內(nèi)外微環(huán)境誘導(dǎo)下的適應(yīng)性變化及機(jī)制顯得十分重要。
   近年來(lái),組蛋白修飾對(duì)干細(xì)胞分化的影響引起了人們的關(guān)注,組蛋白修飾是指不改變細(xì)胞DNA 序列,通過(guò)組蛋白亞基發(fā)生乙?;?、甲基化等共價(jià)修飾,這些修飾可為基因的表達(dá)提供一種識(shí)別的標(biāo)志,為其他蛋白與DNA的結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同或拮抗效應(yīng),它是一種動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄調(diào)控成分,稱為組蛋白密碼。這些密碼可被特定蛋白質(zhì)識(shí)別,將其翻譯成特定的染色質(zhì)狀態(tài)以實(shí)

3、現(xiàn)對(duì)特定基因的調(diào)節(jié),其中,與特異性基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系最為密切的是組蛋白乙?;揎棧芯勘砻?,組蛋白H3 亞基上賴氨酸殘基的乙?;谌旧|(zhì)包裝和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中扮演著重要的角色。一般而言,組蛋白H3K9 乙?;c基因的活化有著密切的關(guān)系,相反的,H3K9 去乙?;c基因的沉默相關(guān)。一旦有乙?;拇嬖?,DNA的構(gòu)型發(fā)生松解,轉(zhuǎn)錄因子得以與核小體中相應(yīng)的順式作用原件結(jié)合同時(shí)募集相應(yīng)反式作用因子,啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。那些組蛋白乙?;潭让芗膮^(qū)域,其下游

4、的DNA呈現(xiàn)出非常活躍的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。那么干細(xì)胞進(jìn)入特定的微環(huán)境以后,是否也是通過(guò)其特定基因發(fā)生了組蛋白修飾,實(shí)現(xiàn)其在特定環(huán)境下重新編程產(chǎn)生與環(huán)境細(xì)胞類似的微環(huán)境適應(yīng)性呢?
   骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymAlstem cells, BMSCs)是一小群存在于骨髓中的非造血細(xì)胞,它具有增殖和多向分化潛能。BMSCs 具有取材方便、擴(kuò)增迅速、可自體移植等特點(diǎn),因此,將其作為種子細(xì)胞用于細(xì)胞治療已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

5、本實(shí)驗(yàn)取材于雌性SD大鼠,分別利用密度梯度離心法和膠原酶消化法,分離培養(yǎng)了BMSCs和BSMCs;并模擬盆底環(huán)境,運(yùn)用接觸共培養(yǎng)方法建立誘導(dǎo)BMSCs 向膀胱平滑肌分化的體外模型,旨在研究BMSCs 體外分化為平滑肌過(guò)程中,平滑肌相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙?;绞欠癜l(fā)生改變,組蛋白乙?;降母淖儗?duì)BMSCs 向BSMCs分化的影響。主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下:
   一、細(xì)胞培養(yǎng)鑒定及共培養(yǎng)模型的建立
   1.大鼠BMS

6、Cs的分離與培養(yǎng) 無(wú)菌操作下取下一月齡雌性SD大鼠雙側(cè)股骨、脛骨,反復(fù)沖洗骨髓腔,混勻沖洗液,離心棄上清后precoll 提取所需單核細(xì)胞層,加入含10%FBS的DMEM-F12 培養(yǎng)液中,置37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所得貼壁細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)其分子表型。結(jié)果:成功分離出形態(tài)為梭形的骨髓單核細(xì)胞,其分子表型為:CD31、CD45 陰性、CD29、CD44、CD166 陽(yáng)性。
   2.大鼠BSMCs的分離與培養(yǎng) 無(wú)菌

7、條件下取一月齡雌性SD大鼠膀胱,采用膠原酶消化法分離單個(gè)核細(xì)胞,含10%FBS的HG-DMEM 培養(yǎng),獲得貼壁細(xì)胞,免疫熒光法鑒定其標(biāo)志蛋白的表達(dá)。結(jié)果:平滑肌特異性的a-SMA, Calponin和 SM-MHC表達(dá)陽(yáng)性。
   3.建立大鼠BSMCs 誘導(dǎo)BMSCs分化的體外共培養(yǎng)模型 以懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室transwell 底層的多孔膜(1um)作為BMSCs和BSMCs 之間的間隔,將BMSCs和BSMCs分別接種于多孔

8、膜兩側(cè)作為實(shí)驗(yàn)組,未經(jīng)過(guò)接觸共培養(yǎng)的同批次BMSCs作為對(duì)照組。取下接觸共培養(yǎng)3日后BMSCs,RT-PCR 檢測(cè)其與對(duì)照組成肌分化平滑肌標(biāo)志性蛋白。結(jié)果:RT-PCR 顯示接觸共培養(yǎng)組較對(duì)照組的BMSCs中平滑肌標(biāo)志性蛋白的表達(dá)量明顯增加,提示BMSCs在接觸共培養(yǎng)體系中成肌分化,建模成功。
   二、組蛋白乙酰化對(duì)BMSCs 向BSMCs分化的影響
   1.ChIP、qPCR分析平滑肌標(biāo)志性基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙?;?/p>

9、水平對(duì)BMSCs 向平滑肌分化的影響 實(shí)驗(yàn)采用ChIP 技術(shù),在活細(xì)胞狀態(tài)下甲醛固定共培養(yǎng)前后BMSCs中蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物,超聲打斷染色質(zhì)片段,調(diào)整片段大小在200-1000bp,然后通過(guò)抗組蛋白特定乙?;稽c(diǎn)H3K9抗體沉淀分化前后BMSCs基因組,定量PCR擴(kuò)增BMSCs中平滑肌標(biāo)志性基因啟動(dòng)子區(qū)DNA 片段,了解干細(xì)胞分化前后啟動(dòng)子區(qū)域乙?;潭鹊淖兓闆r,從而獲得蛋白質(zhì)與DNA 相互作用的信息。結(jié)果:共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后,BM

10、SCs平滑肌標(biāo)志性基因啟動(dòng)子區(qū)乙酰化程度較未分化前明顯增加,啟動(dòng)子區(qū)域DNA的乙?;龠M(jìn)了BMSCs 向BSMCs分化。
   2、組蛋白去乙?;敢种苿℉DACi)丁酸鈉對(duì)BMSCs分化的影響 將二代BSMCs種植于懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室transwell下室面,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后翻轉(zhuǎn)transwell 將其放回含平滑肌培養(yǎng)液的六孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。次日將BMSCs種植于膜內(nèi)面。分組標(biāo)記,實(shí)驗(yàn)組上室內(nèi)加入含3.0mmol/L 丁酸

11、鈉的BMSCs 培養(yǎng)液,對(duì)照組加入普通BMSCs 培養(yǎng)液,分別取下培養(yǎng)1、2、3天BMSCs,細(xì)胞免疫熒光、qPCR分析不同時(shí)間段BMSCs 向BSMCs分化的情況。結(jié)果:HDACi 丁酸鈉可以增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌的分化能力,提高組蛋白乙?;潭瓤梢源龠M(jìn)BMSCs分化。結(jié)論:本研究成功分離出BMSCs及BSMCs,并模擬體內(nèi)環(huán)境建立了誘導(dǎo)分化模型,在該模型的基礎(chǔ)上研究組蛋白乙?;瘜?duì)BMSCs分化能力的影響。研究表明,干細(xì)胞分化后

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