利用葉綠體基因組高變區(qū)標(biāo)記及GISH技術(shù)對(duì)紅花與軟棗獼猴桃種質(zhì)資源的遺傳分析.pdf

1、葉綠體是植物特有的細(xì)胞器，其基因信息被廣泛應(yīng)用于比較基因組學(xué)和植物系統(tǒng)發(fā)育研究。本研究綜合利用已開發(fā)的21對(duì)葉綠體基因組高變片段PCR擴(kuò)增引物，分別分析了國(guó)內(nèi)7個(gè)有代表性的軟棗獼猴桃種質(zhì)資源，以及國(guó)內(nèi)外共36個(gè)紅花種質(zhì)資源，分別探討了軟棗獼猴桃樣品材料之間、紅花品種材料之間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性關(guān)系，運(yùn)用基因組熒光原位雜交技術(shù)，以云紅3號(hào)基因組為探針對(duì)其自身、安徽紅花和哈密有刺紅花的染色體制片進(jìn)行GISH分析和核型分析。研究結(jié)果如下：<

2、br>　　1.利用21對(duì)葉綠體基因組引物對(duì)7個(gè)軟棗獼猴桃基因組DNA模板進(jìn)行了特異性擴(kuò)增并測(cè)序，其中有7個(gè)片段的引物在7個(gè)樣品中全部擴(kuò)增成功，它們分別是petN-psbM、psbM-trnD、petB-petD、rpl32-trnL、trnH-psbA、trnW-psaJ和trnSGCU-trnGGCC。其中片段alpP和ndhF引物在7個(gè)軟棗獼猴桃的基因組中均未擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明alpP和ndhF片段在全部軟棗獼猴桃居群內(nèi)都不存在相應(yīng)片

3、段位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增多態(tài)性和測(cè)序分析顯示，單倍型多態(tài)性水平（h）的變化范圍為0.076-0.050，核苷酸多態(tài)性水平（π）變化范圍為0.00066-0.12003。由于片段rpl32-trnL的分辨率最好，我們使用片段rpl32-trnL引物對(duì)7個(gè)軟棗獼猴桃樣品進(jìn)行分析，分別采用MP算法和NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
　　2.利用RNAStructure5.4軟件對(duì)在7個(gè)軟棗獼猴桃DNA樣本中成功擴(kuò)增并測(cè)序的7個(gè)DNA片段分別進(jìn)行RNA二

4、級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析。選取預(yù)測(cè)結(jié)果中自由能最小的構(gòu)型進(jìn)行比較，結(jié)果顯示petB-petD片段的二級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守。從7個(gè)種的所有RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看，最保守的區(qū)域是1區(qū)，這個(gè)區(qū)域基本沒有結(jié)構(gòu)上的區(qū)別，C臂的保守性很高，在各個(gè)種中都含有2個(gè)內(nèi)環(huán)1個(gè)突環(huán)，并且其中一個(gè)內(nèi)環(huán)明顯較大。在A,B二個(gè)臂上雖然也存在結(jié)構(gòu)差異但是變化不大。2區(qū)位于二級(jí)結(jié)構(gòu)較為中心的位置，含有多分枝環(huán)，突環(huán)，內(nèi)環(huán)，莖干等多種結(jié)構(gòu)單元，除了SN-27，其它6個(gè)種的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)2

5、區(qū)基本相同。將二級(jí)結(jié)構(gòu)與它們的系統(tǒng)樹互相比較，可發(fā)現(xiàn)它們二級(jí)結(jié)構(gòu)的相似程度與系統(tǒng)樹中親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的程度相符合，可以互相印證。
　　3.利用上述21對(duì)被子植物葉綠體基因組高變片段擴(kuò)增引物對(duì)36個(gè)紅花材料基因組DNA模板進(jìn)行了特異性擴(kuò)增并測(cè)序，有6個(gè)片段的引物在36個(gè)樣品中全部擴(kuò)增成功，它們分別是atpH-atpl、alpP、petA-psbJ、petN-psbM、psbM-trnD和trnH-psbA。其中片段rbcL-accD、a

6、ccD-psal、ndhF、psbE-petL、rpoB-trnC和trnSGCU-trnGGCC引物在7個(gè)軟棗獼猴桃的基因組中均未擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明這些片段在全部紅花材料內(nèi)都不存在相應(yīng)片段位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增多態(tài)性和測(cè)序分析顯示，單倍型多態(tài)性水平（h）的變化范圍為0.080-1.000，而核苷酸多態(tài)性水平（π）變化范圍為0.00013-0.09088。利用片段多態(tài)性適中且分辨率最好的petA-psbJ引物對(duì)36個(gè)紅花材料進(jìn)行分析，通過(guò)NJ法

7、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，可將36個(gè)紅花品種分成4個(gè)大類。
　　4.采用酶解去壁低滲火焰干燥法對(duì)3個(gè)品種的紅花（云紅3號(hào)，安徽紅花，哈密有刺）進(jìn)行染色體制片。通過(guò)核型分析，結(jié)果表明：三種紅花染色體數(shù)目均為2n=24，核型公式為2n=2x=24=18m+4sm+2st，屬于2B類型。云紅3號(hào)和安徽紅花的臂比大于2:1的染色體占全部染色體比例為25％，哈密有刺紅花臂比大于2:1的染色體占全部染色體比例為16.67%。利