井岡霉素多拷貝基因簇工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵.pdf

1、井岡霉素是由吸水鏈霉菌5008井岡變種產(chǎn)生的一種氨基糖苷類(lèi)農(nóng)用抗生素。由于其高效、廉價(jià)和安全等顯著特點(diǎn)，自上世紀(jì)70年代，井岡霉素就被廣泛應(yīng)用于水稻紋枯病的防治，其年產(chǎn)量超過(guò)5萬(wàn)噸，為我國(guó)第一大農(nóng)用抗生素。然而，目前工業(yè)高產(chǎn)菌均為誘變得到、易退化，同時(shí)，井岡霉素發(fā)酵所需要的大量淀粉類(lèi)碳源也不利于發(fā)酵成本的節(jié)約。因此，構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的井岡霉素高產(chǎn)菌以及尋找廉價(jià)可替代的生物質(zhì)原料來(lái)降低井岡霉素生產(chǎn)成本是值得嘗試，同時(shí)也對(duì)可持續(xù)的、綠色工業(yè)生產(chǎn)

2、有重要意義。
　　遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)菌對(duì)于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)來(lái)說(shuō)尤為重要。相比較傳統(tǒng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的誘變育種方法，近年來(lái)以基因工程為基礎(chǔ)的代謝工程改造正越來(lái)越多地用于理性提高的菌株發(fā)酵水平。其中基因簇多拷貝復(fù)制被認(rèn)為是一種有效提高抗生素產(chǎn)量的方法。最近報(bào)道的ZouA介導(dǎo)的DNA復(fù)制系統(tǒng)在模式菌--天藍(lán)鏈霉菌中被證明可增加放線紫紅素基因簇的拷貝數(shù)，使得該色素的產(chǎn)量顯著提高。但尚不清楚該系統(tǒng)能否用于其他抗生素生物合成體系，特別是具有重要工業(yè)價(jià)值的抗生

3、素生產(chǎn)中。
　　因此在本學(xué)位論文中，我們從卡那鏈霉菌CGMCC4.1441基因組中克隆得到ZouA系統(tǒng)的三個(gè)重要元件（zouA、RsA和RsB），連同阿伯拉霉素抗性基因（aac(3)IV）分別整合到井岡霉素基因簇的兩端（zouA-RsA和RsB-aac(3)IV）。通過(guò)提高阿伯拉霉素濃度富集含以及脈沖場(chǎng)電泳-Southern雜交驗(yàn)證獲得了含有3-5個(gè)串聯(lián)基因簇的重組菌，并具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
　　隨后的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

4、，重組菌的井岡霉素最高產(chǎn)量為21 g L-1，為野生型的1.3倍，接近目前報(bào)道的改造后的工業(yè)株的最好發(fā)酵水平，表明增加基因簇拷貝數(shù)是一種有效提高井岡霉素產(chǎn)量的方法。此外，重組菌的副產(chǎn)物有效氧胺產(chǎn)量明顯降低，且其井岡霉素和有效氧胺總摩爾數(shù)仍然高于野生型，表明多拷貝基因簇不但增強(qiáng)有效氧胺轉(zhuǎn)化為井岡霉素，同時(shí)也促進(jìn)碳流更多地轉(zhuǎn)向井岡霉素的生物合成。同時(shí)發(fā)現(xiàn)重組菌中結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平和酶量與野生型相比均有明顯提高，表明增加基因簇拷貝數(shù)是一種有效

5、且直接提高結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄水平的策略，也暗示著結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度對(duì)井岡霉素生物合成有重要作用。實(shí)驗(yàn)室3L反應(yīng)器發(fā)酵結(jié)果與搖瓶發(fā)酵相似，重組菌的井岡霉素產(chǎn)量達(dá)到20.8 g L-1，比野生菌提高了1.8倍，表明該重組菌有工業(yè)應(yīng)用的潛力。
　　井岡霉素工業(yè)發(fā)酵需要大量淀粉為碳源，占培養(yǎng)基成本70％左右，因此開(kāi)發(fā)一種以生物質(zhì)水解液為碳源的廉價(jià)培養(yǎng)基不僅有利于降低生產(chǎn)成本，同時(shí)也避免了消耗淀粉類(lèi)糧食。從5008菌株的代謝圖可以發(fā)現(xiàn)木糖理論上可

6、以通過(guò)更短路徑轉(zhuǎn)換為井岡霉素合成前體S7P，以木糖為主的生物質(zhì)原料生產(chǎn)井岡霉素有一定的可行性。因此我們嘗試選用以木糖為主的玉米芯水解液（又稱(chēng)木糖母液）生產(chǎn)井岡霉素。我們首先考察了野生菌以不同濃度玉米芯水解液為碳源對(duì)井岡霉素發(fā)酵影響，發(fā)現(xiàn)以13%（v/v）的玉米芯水解液為碳源井岡霉素產(chǎn)量最高（為9.6 g L-1）。進(jìn)一步通過(guò)單糖和混合糖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在玉米芯水解液的三種主要組分-葡萄糖、木糖和阿拉伯糖中，木糖對(duì)井岡霉素的生物合成起主要貢獻(xiàn)。利

7、用重組菌并結(jié)果補(bǔ)料發(fā)酵策略使井岡霉素的水解液發(fā)酵產(chǎn)量最高達(dá)到17.3 g L-1，接近在大米粉培養(yǎng)基中的產(chǎn)量，而原料成本有效降低，具有工業(yè)應(yīng)用潛力。
　　本論文研究結(jié)果表明，今后一方面可以從提高UDP-葡萄糖供給方面進(jìn)一步改造菌株來(lái)提高井岡霉素發(fā)酵產(chǎn)量，另一方面也可以通過(guò)提高菌株在水解液中的耐受度來(lái)提高水解液中井岡霉素發(fā)酵產(chǎn)量。本論文的研究結(jié)果不僅為下一步菌株的代謝工程改造提供了基礎(chǔ)，也為降低工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基成本做出有益探索。同時(shí)本