產(chǎn)番茄紅素酵母工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵工藝優(yōu)化.pdf

1、番茄紅素是類胡蘿卜素的一種，具有抗氧化、調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝、調(diào)節(jié)膽固醇的代謝、預(yù)防和抑制腫瘤等多種生物活性，廣泛用于醫(yī)療保健領(lǐng)域。為在釀酒酵母中生物合成番茄紅素，本研究首先在釀酒酵母BY4742的δDNA位點(diǎn)整合入來源于成團(tuán)泛菌的CrtB和CrtI基因獲得產(chǎn)番茄紅素的工程菌ZD-Ly-100，再針對(duì)萜類生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因HMG1、IDI、ERG20、SaGGPS和ERG9的表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)控，發(fā)現(xiàn)HMGR和GGPS兩個(gè)關(guān)鍵酶控制二

2、萜的生物合成。
　　生物合成途徑的構(gòu)建與優(yōu)化涉及到多個(gè)基因的同源重組。本研究利用酵母多片段整合技術(shù)，將控制工程菌基本萜類合成的tHMG1基因，及控制GGPP二萜生物合成的關(guān)鍵酶ERG20-BTS1和SaGGPS，用多片段整合技術(shù)一步法整入菌株ZD-Ly-000的rDNA位點(diǎn)，獲得ZD-Ly-201。和菌株ZD-Ly-000相比，ZD-Ly-201番茄紅素的產(chǎn)量顯著提高77.0倍達(dá)到13.23 mg/L。
　　在進(jìn)一步的發(fā)酵過

3、程優(yōu)化中發(fā)現(xiàn):利用指數(shù)補(bǔ)料法可以在保證單位細(xì)胞產(chǎn)率無較大變化的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)相關(guān)工程菌的高細(xì)胞密度，OD600高達(dá)500以上;限制磷酸鹽的供給可以控制細(xì)胞的生長(zhǎng)，有利于目標(biāo)產(chǎn)物的積累;在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期向發(fā)酵罐內(nèi)添加有機(jī)萃取劑，可以減輕細(xì)胞負(fù)擔(dān)，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的積累（提高約2倍）。經(jīng)過系列優(yōu)化后，建立的發(fā)酵方法能較大程度提高番茄紅素工程菌和原人參二醇工程菌等釀酒酵母型工程菌中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量:番茄紅素高密度發(fā)酵產(chǎn)量從13.23 mg/L提高13