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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
阿霉素(doxorubicin)屬于蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素,自從上市以來(lái),已經(jīng)與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用形成了多種腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。臨床上主要用于治療實(shí)體瘤,如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌等。但其毒副作用突出,主要表現(xiàn)為:抑制骨髓,導(dǎo)致蓄積性心臟毒性,甚至造成心力衰竭。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)腫瘤組織微環(huán)境特點(diǎn),分別制備葉酸修飾的pH敏感型阿霉素小分子和大分子偶聯(lián)物,通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),探討偶聯(lián)物的體外抗腫瘤活性以及靶向釋藥特性,為尋找
2、高效、低毒的阿霉素腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)探索新方法。
方法:
分別以氨基己酸和異型雙功能大分子聚乙二醇(MW=5000)為藥物載體,以葉酸為靶向配體,合成聚乙二醇-葉酸偶聯(lián)物(PEG-FA)和氨基己酸-葉酸偶聯(lián)物(AMA-FA),然后將阿霉素(DOX)通過(guò)pH敏感的腙鍵與PEG-FA和AMA-FA連接,得到DOX-hyd-PEG-FA和DOX-hyd-AMA-FA偶聯(lián)物。同時(shí)制備阿霉素-聚乙二醇腙鍵偶聯(lián)物(DOX-hyd-
3、PEG)、阿霉素-聚乙二醇-葉酸酰胺鍵偶聯(lián)物(DOX-ami-PEG-FA)、阿霉素-聚乙二醇酰胺鍵偶聯(lián)物(DOX-ami-PEG)及阿霉素-氨基己酸腙鍵連接物(DOX-hyd-AMA)作為對(duì)照。利用液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS)、紅外(FT-IR)、核磁氫譜(1H-NMR)等方法對(duì)偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。建立HPLC方法測(cè)定偶聯(lián)物的載藥量。采用LC/MS方法研究偶聯(lián)物在不同pH介質(zhì)中的藥物釋放行為。選用葉酸受體表達(dá)陽(yáng)性的人口腔上皮樣腺癌KB細(xì)胞
4、以及葉酸受體表達(dá)陰性的肺癌A549細(xì)胞,用MTT法觀察偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性,同時(shí)觀察外源性葉酸對(duì)偶聯(lián)物細(xì)胞毒性的影響。采用流式細(xì)胞儀以及熒光顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞對(duì)偶聯(lián)物的攝取,并用激光共聚焦顯微鏡考察偶聯(lián)物在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布。
結(jié)果:
1.波譜學(xué)研究結(jié)果表明制備的偶聯(lián)物為目標(biāo)化合物。
2.采用HPLC測(cè)定阿霉素的工作曲線回歸方程為y=47555x-19758,R2=0.9997。通過(guò)酸水解大分子偶聯(lián)物,測(cè)得大分
5、子偶聯(lián)物DOX-ami-PEG,DOX-ami-PEG-FA,DOX-hyd-PEG和DOX-hyd-PEG-FA的載藥量分別為12.8%,13.2%,11.7%和12.6%。
3.DOX-hyd-PEG-FA在pH5.0的緩沖液中,經(jīng)過(guò)50h有94%的阿霉素得到釋放,而在pH6.5和7.4的緩沖液中,經(jīng)過(guò)50h后阿霉素的釋藥率分別為43%和11%;DOX-hyd-AMA-FA也具有類似的釋藥特性。DOX-ami-PEG-FA
6、在pH5.0的緩沖液中,經(jīng)過(guò)50h有12%的阿霉素得到釋放,而在pH6.5和7.4的緩沖液中,經(jīng)過(guò)50h后阿霉素的釋藥率分別為7%和5%。
4.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DOX-hyd-PEG-FA對(duì)葉酸受體陽(yáng)性FR(+)KB細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,其細(xì)胞毒性大于同劑量的無(wú)葉酸連接的偶聯(lián)物DOX-hyd-PEG以及DOX-ami-PEG-FA;細(xì)胞毒性作用能被外源性游離葉酸所抑制。DOX-hyd-AMA-FA也具有類似特
7、點(diǎn)。對(duì)葉酸受體表達(dá)陰性FR(-)A549細(xì)胞的結(jié)果表明,無(wú)葉酸偶聯(lián)物與有葉酸偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性無(wú)明顯差異,但腙鍵偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性大于酰胺鍵偶聯(lián)物。
5.流式細(xì)胞儀測(cè)定不同偶聯(lián)物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度,結(jié)果表明DOX-hyd-PEG-FA偶聯(lián)物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于DOX-hyd-PEG,并具有一定的時(shí)間依賴性。
6.熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),KB細(xì)胞對(duì)DOX-hyd-AMA-FA的攝取量明顯多于DOX-hyd-AMA
8、,A549細(xì)胞對(duì)DOX-hyd-AMA-FA和DOX-hyd-AMA的攝取量無(wú)明顯差異;KB細(xì)胞對(duì)DOX-hyd-PEG-FA的攝取量明顯多于DOX-hyd-PEG,DOX-hyd-PEG-FA可使更多的DOX蓄積于細(xì)胞核。
7.激光共聚焦研究結(jié)果表明,DOX-hyd-PEG-FA首先進(jìn)入腫瘤細(xì)胞溶酶體,然后阿霉素再分布于細(xì)胞核。
結(jié)論:
DOX-hyd-AMA-FA和DOX-hyd-PEG-FA可通過(guò)葉酸
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