具有酸敏特性的阿霉素—葉酸偶聯(lián)物的制備及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、目的：
　　阿霉素(doxorubicin)屬于蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，自從上市以來，已經(jīng)與其它藥物聯(lián)合應用形成了多種腫瘤的標準治療方法。臨床上主要用于治療實體瘤，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌等。但其毒副作用突出，主要表現(xiàn)為：抑制骨髓，導致蓄積性心臟毒性，甚至造成心力衰竭。本實驗根據(jù)腫瘤組織微環(huán)境特點，分別制備葉酸修飾的pH敏感型阿霉素小分子和大分子偶聯(lián)物，通過體外細胞實驗，探討偶聯(lián)物的體外抗腫瘤活性以及靶向釋藥特性，為尋找

2、高效、低毒的阿霉素腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)探索新方法。
　　方法：
　　分別以氨基己酸和異型雙功能大分子聚乙二醇(MW=5000)為藥物載體，以葉酸為靶向配體，合成聚乙二醇-葉酸偶聯(lián)物(PEG-FA)和氨基己酸-葉酸偶聯(lián)物(AMA-FA)，然后將阿霉素(DOX)通過pH敏感的腙鍵與PEG-FA和AMA-FA連接，得到DOX-hyd-PEG-FA和DOX-hyd-AMA-FA偶聯(lián)物。同時制備阿霉素-聚乙二醇腙鍵偶聯(lián)物(DOX-hyd-

3、PEG)、阿霉素-聚乙二醇-葉酸酰胺鍵偶聯(lián)物(DOX-ami-PEG-FA)、阿霉素-聚乙二醇酰胺鍵偶聯(lián)物(DOX-ami-PEG)及阿霉素-氨基己酸腙鍵連接物(DOX-hyd-AMA)作為對照。利用液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS)、紅外(FT-IR)、核磁氫譜(1H-NMR)等方法對偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)進行表征。建立HPLC方法測定偶聯(lián)物的載藥量。采用LC/MS方法研究偶聯(lián)物在不同pH介質(zhì)中的藥物釋放行為。選用葉酸受體表達陽性的人口腔上皮樣腺癌KB細胞

4、以及葉酸受體表達陰性的肺癌A549細胞，用MTT法觀察偶聯(lián)物的細胞毒性，同時觀察外源性葉酸對偶聯(lián)物細胞毒性的影響。采用流式細胞儀以及熒光顯微鏡觀察腫瘤細胞對偶聯(lián)物的攝取，并用激光共聚焦顯微鏡考察偶聯(lián)物在亞細胞結(jié)構(gòu)中的分布。
　　結(jié)果：
　　1.波譜學研究結(jié)果表明制備的偶聯(lián)物為目標化合物。
　　2.采用HPLC測定阿霉素的工作曲線回歸方程為y=47555x-19758，R2=0.9997。通過酸水解大分子偶聯(lián)物，測得大分

5、子偶聯(lián)物DOX-ami-PEG，DOX-ami-PEG-FA，DOX-hyd-PEG和DOX-hyd-PEG-FA的載藥量分別為12.8％，13.2％，11.7％和12.6％。
　　3.DOX-hyd-PEG-FA在pH5.0的緩沖液中，經(jīng)過50h有94％的阿霉素得到釋放，而在pH6.5和7.4的緩沖液中，經(jīng)過50h后阿霉素的釋藥率分別為43％和11％；DOX-hyd-AMA-FA也具有類似的釋藥特性。DOX-ami-PEG-FA

6、在pH5.0的緩沖液中，經(jīng)過50h有12％的阿霉素得到釋放，而在pH6.5和7.4的緩沖液中，經(jīng)過50h后阿霉素的釋藥率分別為7％和5％。
　　4.MTT實驗結(jié)果表明，DOX-hyd-PEG-FA對葉酸受體陽性FR(+)KB細胞的生長抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，其細胞毒性大于同劑量的無葉酸連接的偶聯(lián)物DOX-hyd-PEG以及DOX-ami-PEG-FA；細胞毒性作用能被外源性游離葉酸所抑制。DOX-hyd-AMA-FA也具有類似特

7、點。對葉酸受體表達陰性FR(-)A549細胞的結(jié)果表明，無葉酸偶聯(lián)物與有葉酸偶聯(lián)物的細胞毒性無明顯差異，但腙鍵偶聯(lián)物的細胞毒性大于酰胺鍵偶聯(lián)物。
　　5.流式細胞儀測定不同偶聯(lián)物在腫瘤細胞內(nèi)的熒光強度，結(jié)果表明DOX-hyd-PEG-FA偶聯(lián)物在腫瘤細胞內(nèi)的熒光強度明顯強于DOX-hyd-PEG，并具有一定的時間依賴性。
　　6.熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，KB細胞對DOX-hyd-AMA-FA的攝取量明顯多于DOX-hyd-AMA

8、，A549細胞對DOX-hyd-AMA-FA和DOX-hyd-AMA的攝取量無明顯差異；KB細胞對DOX-hyd-PEG-FA的攝取量明顯多于DOX-hyd-PEG，DOX-hyd-PEG-FA可使更多的DOX蓄積于細胞核。
　　7.激光共聚焦研究結(jié)果表明，DOX-hyd-PEG-FA首先進入腫瘤細胞溶酶體，然后阿霉素再分布于細胞核。
　　結(jié)論：
　　DOX-hyd-AMA-FA和DOX-hyd-PEG-FA可通過葉酸