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文檔簡介
1、弓形蟲,為頂復(fù)動(dòng)物門寄生原蟲,可感染人類和幾乎其他所有的溫血?jiǎng)游?,常引起孕婦妊娠階段流產(chǎn),胎兒畸形、先天性缺陷或死胎等嚴(yán)重后果,免疫能力低下人群感染嚴(yán)重疾病。近幾年研究表明,弓形蟲還會(huì)影響宿主的一些行為舉止,甚至與多種精神疾病有關(guān)。據(jù)國外報(bào)道,人感染弓形蟲的平均感染率為25%~50%。而我國的人群感染率在0.1%~47.3%,豬感染率為4.78%~85.7%,牛的感染率為0.2%~43.4%。可見弓形蟲病已經(jīng)嚴(yán)重影響了人類的健康生活和畜
2、牧業(yè)的發(fā)展。
蛋白激酶(Protein Kinase,PK)在弓形蟲增殖、分化和感染過程中起著至關(guān)重要的作用。以往研究表明,鈣依賴蛋白激酶Ⅰ(CDPK1)在弓形蟲胞吐中起著重要的調(diào)節(jié)作用;絲裂原活化蛋白激酶Ⅰ(MAPK1)通過誘導(dǎo)一氧化氮復(fù)合物(iNOS)合成抑制干擾素(IFN)合成,調(diào)節(jié)弓形蟲的增殖;棒狀體蛋白激酶是一種弓形蟲特有的蛋白激酶,參與調(diào)控弓形蟲對宿主免疫反應(yīng)的影響。酪蛋白激酶(CK)是真核生物的一種保守的絲/蘇氨
3、酸蛋白激酶,由Bnrnet在1954年在大鼠的肝臟中發(fā)現(xiàn)的,其功能是催化肽鏈中鄰近酸性氨基酸殘基的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化。該蛋白激酶由Ⅰ型酪蛋白激酶(Casein Kinase1,CK1)和Ⅱ型酪蛋白激酶(Casein Kinase2,CK2)兩大家族蛋白組成。CK1參與調(diào)節(jié)多種重要的細(xì)胞過程,包括wnt信號通路、膜運(yùn)輸、細(xì)胞骨架的維護(hù)等。最近研究發(fā)現(xiàn)多種原核生物有CK1基因表達(dá),如弓形蟲、瘧原蟲、利氏曼原蟲、錐蟲等。此外, CK1抑制劑
4、還可以抑制鞭毛蟲和錐蟲在血液中的增殖。
CK1在機(jī)體多種生理活動(dòng)中發(fā)揮著舉足輕重的作用,如細(xì)胞分裂與凋亡、DNA修復(fù)、P53調(diào)控、周期性節(jié)律等。弓形蟲基因組可以編碼CK1α和CK1β兩種CK1亞型,其中只有CK1α具有酶活性。CK1α是一種非第二信使依賴的激酶,以ATP作為單一磷酸供體,分布于細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核中。在哺乳動(dòng)物中,CK1α參與多種細(xì)胞生理活動(dòng),如細(xì)胞周期、染色體分離、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等。此外
5、,CK1α參與Wnt/β-Cat、Hedgehog(Hh)及NF-κB等信號通路。弓形蟲作為一種重要的模式生物和人獸共患病原, CK1α基因在其感染宿主過程中的作用還不清楚。
研究目的:
利用實(shí)驗(yàn)室已有的CK1α克隆缺失株(△ck1α)感染BALB/c小鼠,通過與野生株GT1對比,確定CK1α對弓形蟲感染宿主毒力的影響。利用熒光定量PCR、ELISA、轉(zhuǎn)錄組測序和Western blot等方法,推論出CK1α調(diào)節(jié)弓形
6、蟲毒力的具體機(jī)制。為預(yù)防弓形蟲感染,研制疫苗和治療藥物提供一定的依據(jù)。
研究內(nèi)容:
1、通過小鼠攻蟲試驗(yàn),確定CK1α缺失對弓形蟲毒力的影響;
2、研究CK1α調(diào)節(jié)弓形蟲毒力的具體機(jī)制。
研究方法:
1、確定CK1α對弓形蟲毒力的影響
90只6~8周齡BALB/c雌性小鼠,采用隨機(jī)分組的方法分為9組,每組十只小鼠,每只小鼠腹腔接種200μL弓形蟲速殖子稀釋液。第一組:每只小鼠接
7、種102個(gè)GT1速殖子;第二組:每只小鼠接種103個(gè)GT1速殖子;第三組:每只小鼠接種104個(gè)GT1速殖子;第四組:每只小鼠接種102個(gè)△ck1α速殖子;第五組:每只小鼠接種103個(gè)△ck1α速殖子;第六組:每只小鼠接種104個(gè)△ck1α速殖子;第七組:每只小鼠接種102個(gè)CK1α回補(bǔ)株速殖子;第八組:每只小鼠接種103個(gè)CK1α回補(bǔ)株速殖子;第九組:每只小鼠接種104個(gè)CK1α回補(bǔ)株速殖子;根據(jù)小鼠死亡時(shí)間繪制生存曲線,分析CK1α缺
8、失對于宿主生存時(shí)間的影響。在感染第3天和第7天處死感染小鼠,觀察小鼠肝組織損傷狀況, ELISA檢測天冬門氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate Aminotransferase,AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine Transaminase,ALT)含量,定量PCR(RT-PCR)檢測肝臟組織和脾臟組織荷蟲量,流式細(xì)胞術(shù)檢測血清中IL-12、IFN-γ等細(xì)胞因子含量,分析CK1α缺失對弓形蟲毒力的影響。
2、確定CK1α調(diào)節(jié)弓形
9、蟲毒力的機(jī)制
取感染3天和7天小鼠的肝臟組織和脾臟組織, Western blot檢測肝臟組織和脾臟組織中MAPK信號通路、NF-κB信號通路和STAT信號通路活化情況,熒光定量PCR(RT-PCR)檢測肝臟組織和脾臟組織中IL-12、IFN-γ等細(xì)胞因子含量,轉(zhuǎn)錄組測序檢測棒狀體蛋白轉(zhuǎn)錄水平變化。確定CK1α調(diào)節(jié)弓形蟲毒力的具體機(jī)制。
研究結(jié)果:
1、CK1α缺失后,小鼠生存時(shí)間減短。
第三組小
10、鼠在腹腔注射5天后出現(xiàn)明顯的體外特征,在注射7-9天內(nèi)死亡,平均存活時(shí)間(MST)為7.7天。第一組和第二組小鼠在注射后10-13天死亡, MST分別為11.4天和10.4天。第六組小鼠在腹腔注射后4天出現(xiàn)明顯癥狀,在注射6-8天死亡,MST為6.8天。第四組和第五組在注射后8-12天死亡,MST分別為10.5天和8.4天。注射回補(bǔ)株組MST與等量注射GT1速殖子組MST無明顯差異(P>0.05)。
2、CK1α缺失后,弓形蟲
11、毒力增加。
△ck1α感染小鼠,肝組織較GT1野生株出現(xiàn)明顯的病理性損傷;天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)含量相較于GT1感染小鼠均提高了4~6倍,而谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量提高了2~4倍;肝脾組織荷蟲量均明顯高于GT1感染小鼠;△ck1α感染小鼠血清中IL-12和IFN-γ分泌量低于GT1感染小鼠。
3、△ck1α通過ROP16活化STAT3抑制IL-12分泌,增加弓形蟲毒力。
△ck1α感染小鼠,肝脾組織
12、中 MAPK信號通路蛋白和NF-κB信號通路蛋白基本無明顯差異,只有肝組織內(nèi)MAPK p38磷酸化程度增加,這可能是導(dǎo)致肝組織嚴(yán)重?fù)p傷的原因。肝脾組織中STAT1/4蛋白磷酸化程度均低于GT1感染小鼠,STAT3/6明顯高于GT1,轉(zhuǎn)錄組測序檢測發(fā)現(xiàn)ROP16蛋白分泌量△ck1α感染小鼠明顯高于GT1。
研究結(jié)論:
1、△ck1α感染小鼠生存時(shí)間明顯減短, CK1α缺失后,弓形蟲毒力顯著增強(qiáng);
2、△ck1
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