DNA修復(fù)酶活性檢測的熒光生物傳感方法研究.pdf

1、DNA修復(fù)酶能參與DNA損傷的修復(fù)過程，保護基因組免受DNA損傷的危害，進(jìn)而維持基因組的完整性。DNA修復(fù)酶活性的異常將對DNA損傷的修復(fù)過程產(chǎn)生干擾，從而導(dǎo)致各種疾病，包括早熟衰老癥、發(fā)育障礙、腫瘤、神經(jīng)退化性疾病等。因此，對DNA修復(fù)酶活性的檢測，有利于在功能研究和臨床診斷中評價DNA損傷的修復(fù)過程。
　　近年來，由于具有操作簡捷、生物相容性好等優(yōu)點，基于DNA的熒光生物傳感方法已成為定量檢測生物分子的常用分析方法。這種方法將

2、DNA作為識別探針來對特定的目標(biāo)物進(jìn)行識別，并能將該識別事件轉(zhuǎn)換成可以檢測的熒光信號。目前，基于DNA的熒光生物傳感方法已被用于DNA修復(fù)酶的活性檢測中。然而，這些方法仍存在一些不足:1）需要標(biāo)記或修飾，以及靈敏度低;2）需要同時移除多個損傷堿基才能實現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，限制了靈敏度的提高;3）每種方法只能對一種DNA修復(fù)酶的活性進(jìn)行檢測，不足以評價DNA損傷的修復(fù)過程。
　　本論文發(fā)展了檢測DNA修復(fù)酶活性的新型熒光生物傳感方法。其中

3、，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、內(nèi)切酶Ⅳ(EndoⅣ)以及無嘌呤/無嘧啶內(nèi)切酶1(APE1)被選作DNA修復(fù)酶的模型。本論文主要分為四章:
　　第一章為緒論部分，主要概述了DNA修復(fù)酶的概念、分類、功能、研究意義以及現(xiàn)有的檢測方法。此外，本部分還總結(jié)了現(xiàn)階段DNA修復(fù)酶活性檢測領(lǐng)域中存在的主要問題。
　　第二章，構(gòu)建了一種基于免標(biāo)記DNA機器的熒光信號擴增方法用于靈敏檢測UDG的活性。在本方法中，我們設(shè)計了一個含有尿嘧啶

4、(U)堿基和引物序列的雙鏈DNA探針，它作為DNA機器的引發(fā)部分能進(jìn)行UDG的識別和信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，我們還設(shè)計了兩個部分互補的發(fā)夾探針，它們作為DNA機器的運行部分能用于信號的擴增。在UDG的作用下，雙鏈DNA探針中的U堿基被移除，產(chǎn)生無嘌呤/無嘧啶(AP)位點，導(dǎo)致雙鏈結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而發(fā)生解離，釋放出引物序列。隨后，該引物序列能引發(fā)DNA機器的運行，產(chǎn)生大量的G-四倍體(G4)結(jié)構(gòu)。最后，G4結(jié)構(gòu)能與N-甲基-卟啉Ⅸ(NMM)發(fā)生特異性

5、地結(jié)合，生成G4-NMM復(fù)合物，并產(chǎn)生增強的熒光信號。本方法能檢測低至0.00044 U/mL的 UDG活性。本方法也能用于檢測人宮頸癌(HeLa)細(xì)胞裂解液中的UDG活性。另外，本方法也能成功檢測抑制劑對UDG活性的抑制。
　　第三章，構(gòu)建了一種基于粘性末端介導(dǎo)鏈置換的熒光信號擴增方法，它能對少量U堿基的移除產(chǎn)生響應(yīng)，進(jìn)而實現(xiàn)對UDG活性的靈敏檢測。在本方法中，我們設(shè)計了一個單鏈DNA識別探針，它含有引物序列和兩個U堿基。另外，

6、我們還設(shè)計了一個含有粘性末端的發(fā)夾探針，以及一個信號報道探針。在UDG的作用下，單鏈DNA探針中的兩個U堿基被移出，產(chǎn)生AP位點。該含有AP位點的單鏈DNA探針將不能與含粘性末端的發(fā)夾探針發(fā)生粘性末端介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)(TSDR)，從而使單鏈DNA探針中的引物序列仍能自由存在。隨后，該引物序列與信號報道探針發(fā)生雜交，進(jìn)而引發(fā)聚合切刻等溫擴增反應(yīng)，實現(xiàn)了對少量U堿基移除的靈敏響應(yīng)，提高了檢測UDG活性的靈敏度。然而，當(dāng)UDG不存在時，單鏈D

7、NA探針能與含粘性末端的發(fā)夾探針發(fā)生TSDR，導(dǎo)致引物序列被封閉，從而不能引發(fā)后續(xù)的等溫擴增反應(yīng)，降低了陰性信號。本方法能檢測低至0.000027 U/mL的UDG活性。
　　第四章，構(gòu)建了一種雙識別發(fā)夾探針介導(dǎo)的熒光信號擴增方法用于靈敏且選擇性地檢測UDG和EndoⅣ的活性。當(dāng)檢測UDG的活性時，探針中的U堿基被目標(biāo)酶移除，產(chǎn)生AP位點，實現(xiàn)了對UDG的識別。接著，AP位點被工具酶EndoⅣ切刻，從而使探針釋放出引物序列以引發(fā)滾

8、環(huán)擴增(RCA)反應(yīng)。最后，RCA反應(yīng)產(chǎn)生大量重復(fù)的G4序列以進(jìn)行熒光信號的輸出。另外，當(dāng)檢測EndoⅣ的活性時，探針中的U堿基首先被工具酶UDG轉(zhuǎn)換成AP位點。接著，AP位點被目標(biāo)酶切刻，實現(xiàn)了對EndoⅣ的識別。最后，結(jié)合RCA的信號擴增能力，實現(xiàn)對EndoⅣ活性的靈敏檢測。本方法對UDG和EndoⅣ活性的檢測限分別為0.00017 U/mL和0.11 U/mL。并且，本方法能將UDG和EndoⅣ與相應(yīng)的類似物很好地區(qū)分開來。另外，

9、本方法也實現(xiàn)了對APE1活性的檢測。
　　第五章，利用連接酶反應(yīng)，構(gòu)建了一種熒光信號擴增方法用于檢測UDG的活性。當(dāng)UDG存在時，識別探針中的兩個U堿基被移除而產(chǎn)生AP位點，形成錯配切口。基于DNA連接酶能夠連接兩側(cè)堿基對完全匹配的切口而不能連接3'側(cè)含錯配的切口的性質(zhì)，形成的上述錯配切口將不能被DNA連接酶連接，探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)保持完整，進(jìn)而引發(fā)隨后的信號擴增及產(chǎn)生過程，實現(xiàn)了對少量U堿基移除的靈敏響應(yīng)，有助于提高UDG活性的檢測