髓系細胞高表達TL1A在實驗性小鼠肝纖維化發(fā)生和逆轉(zhuǎn)過程中作用的研究.pdf

1、肝纖維化是多種慢性肝臟疾病向肝硬化發(fā)展過程中的必經(jīng)階段，是各種病因?qū)е卵装Y、壞死等組織損傷的修復反應。若肝纖維化進程得不到阻抑或逆轉(zhuǎn)則可能進展為失代償期肝硬化，并出現(xiàn)各種終末期肝病并發(fā)癥，嚴重影響患者生存質(zhì)量和預后。但目前肝纖維化的治療效果不甚理想，尚乏有效治療手段。因此，對肝纖維化的深入研究極具必要性和重要意義。
　　肝纖維化的病理特征是細胞外間質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的過量沉積。肝臟內(nèi)多種細胞以

2、不同形式參與肝纖維化形成，其中肝星狀細胞（hepatic stellate cells, HSCs）的活化、增殖，產(chǎn)生大量ECM是肝纖維化發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)。巨噬細胞是機體重要的固有免疫細胞，主要通過吞噬作用清除病原體和異物，并介導炎癥反應。此外，巨噬細胞還具有免疫調(diào)節(jié)和抗原遞呈功能。既往研究證實在肝纖維化發(fā)生階段持續(xù)的損傷刺激可誘導巨噬細胞向肝臟募集并分泌大量具有促炎、促纖維化功能的細胞因子，通過促進HSCs活化和增殖參與肝纖維化進程，在

3、該過程中通過減少巨噬細胞向肝臟募集或抑制其功能均能減輕肝纖維化程度。然而，在肝纖維化恢復階段巨噬細胞發(fā)揮截然相反的作用，主要通過分泌一系列基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）加速ECM降解，在此過程中減少巨噬細胞募集可顯著阻止肝纖維化恢復。因此，深入研究巨噬細胞功能及其作用機制可能為臨床中肝纖維化的治療提供新思路。
　　腫瘤壞死因子樣配體1A（TNF-like ligand1 aberran

4、ce, TL1A）又稱為血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子（vascular endothelial growth inhibitor, VEGI），是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤壞死因子家族新成員，主要有促進炎癥反應和抑制血管生成兩方面作用。對TL1A促進炎癥反應的研究主要集中在自身免疫性疾病領域，如類風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease, IBD）等。其中，在硫酸葡聚糖（dextran sulfa

5、te sodium， DSS）誘導的實驗性小鼠結腸炎模型中發(fā)現(xiàn)髓系單核細胞（巨噬細胞和樹突狀細胞）高表達TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比腸纖維化程度更重，而應用TL1A抗體干預可減輕腸道炎癥和纖維化，從而證實TL1A參與腸纖維化發(fā)生。近期在原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis, PBC）的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，PBC患者血清和肝組織中TL1A表達顯著高于正常人群，并進一步在肝組織枯否細胞和浸潤的單核細胞中

6、發(fā)現(xiàn)TL1A表達增加，提示TL1A可能參與肝纖維化發(fā)生。
　　TL1A與血管生成的研究主要集中在腫瘤領域。業(yè)已證實，TL1A通過抑制血管生成抑制腫瘤生長和腫瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移。血管生成在肝纖維化發(fā)生和逆轉(zhuǎn)階段發(fā)揮截然相反的作用。在肝纖維化發(fā)生時，肝細胞水腫、炎癥壞死造成局部組織缺氧促進新生血管生成，有助于炎細胞浸潤和炎癥反應發(fā)生，從而加重肝纖維化，在此過程中通過抑制血管生成可減輕肝纖維化程度。近期研究發(fā)現(xiàn)，血管生成利于巨噬細胞向肝臟募

7、集，在肝纖維化逆轉(zhuǎn)階段促進ECM降解。但目前尚無TL1A及其相關的血管改變在肝纖維化逆轉(zhuǎn)中的研究。
　　本實驗通過 CCl4腹腔注射構建肝纖維化模型及其自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型，利用髓系細胞高表達TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠作對比，探討髓系細胞高表達TL1A在肝纖維化發(fā)生和逆轉(zhuǎn)中的作用。提取兩種小鼠的骨髓來源巨噬細胞和腹腔巨噬細胞，研究 TL1A對巨噬細胞分泌細胞因子的影響。進一步收集巨噬細胞上清液干預小鼠原代HSCs，探討TL1A高表達

8、巨噬細胞在HSCs膠原代謝中的作用。實驗內(nèi)容主要包括以下三部分：第一部分髓系細胞高表達TL1A對實驗性小鼠肝纖維化發(fā)生的影響
　　目的：探討髓系細胞（巨噬細胞和樹突狀細胞）高表達TL1A對CCl4誘導的小鼠肝損傷和肝纖維化程度的影響。
　　方法：將髓系細胞高表達 TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠（ FMS-TL1A-GFP-transgenic, M-Tg）與有相同遺傳背景的C57BL/6野生型（wild type, WT）小鼠（6~8

9、周）隨機分為Control/WT組、Oil/WT組、CCl4/WT組、Control/Tg組、Oil/Tg組及CCl4/Tg組，每組10只。采用腹腔注射10％CCl4橄欖油溶液（5μL·g-1，每周二、五分別給藥一次）建立小鼠肝纖維化模型，并設立單純注射生理鹽水和橄欖油作為對照（Control）組和橄欖油溶劑對照（Oil）組。采用F4/80和TL1A免疫熒光雙標記法檢測TL1A的定位分布，Real-time Q-PCR技術和Wester

10、n blot技術檢測TL1A在肝組織中的定量表達；自動生化儀檢測小鼠肝功能改變；Haematoxylin and eosin staining（H&E染色）觀察肝臟組織病理學改變；末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標記（ terminal deoxynucleotidy transferrase UTP-nick end labeling, TUNEL）法檢測肝細胞凋亡情況；天狼猩紅染色方法和羥脯氨酸檢測法評估肝纖維化程度

11、；免疫組織化學染色、Real-time Q-PCR技術和Western blot技術檢測Collagen1α1和α-SMA表達變化；Real-time Q-PCR技術和Western blot技術檢測MMP-2和MMP-9表達變化。
　　結果：1)應用基因FMS-TL1A-GFP特定引物序列擴增小鼠DNA后凝膠成像測定，Tg小鼠目的基因在191 bp位置成像，而WT小鼠在191 bp位置無目的基因表達，據(jù)此可以篩選鑒定髓系細胞高表

12、達TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠。2)小鼠肝纖維化模型成功建立：CCl4/WT組肝組織H&E染色可見炎細胞浸潤增多、小葉結構紊亂、匯管區(qū)擴大；天狼猩紅染色顯示纖維結締組織明顯增多。3) CCl4/WT組肝組織中TL1A和F4/80免疫熒光共染方法檢測到 TL1A表達于巨噬細胞中。檢測 TL1A的平均光密度顯示， CCl4/WT組中平均光密度值顯著高于 Oil/WT組（0.031±0.005 vs0.021±0.003, P<0.01）；CCl4/

13、Tg組顯著高于CCl4/WT組（0.053±0.007 vs0.031±0.005, P<0.01）。Real time Q-PCR檢測肝組織中TL1A mRNA表達， CCl4/WT組中 TL1A mRNA的相對表達量（3.57±0.81）顯著高于Control/WT組（1±0.02）和 Oil/WT組（1.29±0.31），P<0.01；CCl4/Tg組的 TL1A mRNA相對表達量（11.5±1.87）顯著高于 Control/

14、Tg組（6.94±0.71）和Oil/Tg組（7.08±1.15），P<0.01；且CCl4/Tg組顯著高于CCl4/WT組（11.5±1.87 vs3.57±0.81, P<0.01）。Western blot分析各組TL1A蛋白表達， CCl4/WT組中 TL1A蛋白表達量（0.26±0.05）顯著高于Control/WT組（0.13±0.02）和Oil/WT組（0.15±0.05）；CCl4/Tg組中TL1A蛋白表達量（0.72±

15、0.08）顯著高于 Control/Tg組（0.36±0.04）和 Oil/Tg組（0.38±0.05），P<0.05；且CCl4/Tg組顯著高于CCl4/WT組（0.72±0.08 vs0.26±0.05, P<0.01）。4)生化法檢測各組肝功能變化，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間ALT、AST和TBIL水平差異均無統(tǒng)計學意義，P>0.05； CCl4/WT組肝功能損傷明顯重于 O

16、il/WT組（ALT：190.4 U/L±10.4 U/L vs8.3 U/L±3.7 U/L, P<0.05；AST：220.5 U/L±19.3 U/L vs58.5 U/L±14.5 U/L, P<0.05；TBIL：6μmol/L±1.07μmol/Lvs2.81μmol/L±0.66μmol/L, P<0.05）；CCl4/Tg組肝功能損傷明顯重于CCl4/WT組（ALT：222.4 U/L±5.2 U/L vs190.4 U

17、/L±10.4 U/L, P<0.05；AST：270.8 U/L±19.7 U/L vs220.5 U/L±19.3 U/L, P<0.05；TBIL：9.09μmol/L±0.9μmol/L vs6μmol/L±1.07μmol/L, P<0.05）。5) H&E染色觀察肝組織內(nèi)肝細胞壞死情況，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組未見肝細胞壞死；CCl4/WT組和CCl4/Tg組可見肝細胞水

18、腫、胞漿疏松化，肝內(nèi)匯管區(qū)炎癥細胞浸潤增加，匯管區(qū)及周圍碎屑樣壞死。壞死面積統(tǒng)計CCl4/Tg組較CCl4/WT組顯著升高（39.5%±5.1%vs25.8%±3.6%, P<0.05）。6) TUNEL法檢測肝細胞凋亡情況，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組每個視野下凋亡細胞的數(shù)量分別為4±1、5±2、5±1、4±1，各組間差異無統(tǒng)計學意義；CCl4/WT組比Oil/WT組肝細胞凋亡明顯增多

19、（28±5 vs5±2，P<0.01），CCl4/Tg組比CCl4/WT組肝細胞凋亡顯著增加（46±6 vs28±5，P<0.01）。7)天狼猩紅染色陽性面積百分比在Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和 Oil/Tg組依次為0.24%±0.05%、0.28%±0.08%、0.27%±0.04%、0.26%±0.06%，各組間差異無統(tǒng)計學意義， P>0.05；CCl4/WT組的陽性面積（1.43%±0.21%）

20、明顯高于 Oil/WT組， P<0.01；且CCl4/Tg組的陽性面積（1.85%±0.14%）明顯高于CCl4/WT組， P<0.01。羥脯氨酸法檢測總膠原水平， Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組羥脯氨酸含量依次為83μg/g±5μg/g、89μg/g±7μg/g、86μg/g±8μg/g、92μg/g±10μg/g，各組間差異均無統(tǒng)計學意義， P>0.05；CCl4/WT（130μg/g

21、±10μg/g）組較Oil/WT組羥脯氨酸含量明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組（162μg/g±14μg/g）較CCl4/WT組明顯升高， P<0.05。8)免疫組織化學染色、Real time Q-PCR和Western blot方法檢測各組Collagen1α1表達，在Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組間Collagen1α1表達差異均無統(tǒng)計學意義，P>0.05；免疫組織化學染色方

22、法檢測Collagen1α1陽性面積顯示CCl4/WT組（1.26%±0.31%）顯著高于Oil/WT組（0.3%±0.13%），P<0.01；CCl4/Tg組的陽性染色面積顯著高于CCl4/WT組（2.96%±0.72%vs1.26%±0.31%, P<0.01）。Real time Q-PCR檢測肝組織中Collagen1α1 mRNA的表達，CCl4/WT組相對表達量（3.67±0.48）較Oil/WT組（1.24±0.2）明顯升

23、高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（5.08±0.72 vs3.67±0.48, P<0.01）；Western blot技術檢測各組Collagen1α1蛋白表達，CCl4/WT組（0.85±0.07）較Oil/WT組（0.68±0.08）Collagen1α1蛋白的表達量明顯升高, P<0.05；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（1.27±0.08 vs0.85±0.07, P<0.01）。9)免

24、疫組織化學染色、Real time Q-PCR和Western blot方法檢測各組α-SMA表達，在Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組間α-SMA表達差異均無統(tǒng)計學意義，P>0.05；免疫組織化學染色方法檢測α-SMA蛋白表達， CCl4/WT組陽性染色面積（2.73%±0.68%）顯著高于 Oil/WT組（0.34%±0.08%），P<0.01；CCl4/Tg組的陽性染色面積顯著高于CCl

25、4/WT組（3.85%±0.65%vs2.73%±0.68%, P<0.05）。Real time Q-PCR檢測肝組織中α-SMA mRNA的表達，CCl4/WT組α-SMA mRNA的相對表達量（3.18±1.25）較Oil/WT組（1.17±0.16）明顯升高，P<0.05；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（4.6±0.6 vs3.18±1.25, P<0.05）。Western blot技術檢測α-SMA蛋白表達， C

26、Cl4/WT組（1.35±0.11）較Oil/WT組（1.01±0.08）α-SMA蛋白的表達量明顯升高，P<0.05；CCl4/Tg組較 CCl4/WT組明顯升高（1.63±0.1 vs1.35±0.11, P<0.01）。10) Real time Q-PCR和Western blot方法檢測肝組織中MMP-2的表達，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間均無統(tǒng)計學差異，P>0.05；MM

27、P-2 mRNA的相對表達量在CCl4/WT組（5.3±1.6）較Oil/WT組（1.02±0.23）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（10.4±2.8 vs5.3±1.6, P<0.01）。MMP-2蛋白表達在CCl4/WT組（1.15±0.11）較Oil/WT組（0.55±0.08）明顯升高， P<0.01；CCl4/Tg組較 CCl4/WT組明顯升高（1.31±0.06 vs1.15±0.11,

28、P<0.05）。11) Real time Q-PCR和Western blot方法檢測肝組織中MMP-9的表達， Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間均無統(tǒng)計學差異，P>0.05；MMP-9 mRNA的表達在CCl4/WT組（4.99±1.73）較Oil/WT組（1.08±0.14）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（9.97±1.97 vs4.99±1.7

29、3, P<0.01）。MMP-9蛋白表達在CCl4/WT組（0.51±0.09）較 Oil/WT組（0.22±0.04）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（0.72±0.12 vs0.51±0.09, P<0.05）。
　　第二部分 TL1A高表達的巨噬細胞參與肝纖維化進程的機制
　　目的：探討TL1A高表達的巨噬細胞參與肝纖維進程的體內(nèi)外機制。
　　方法：動物實驗分組同第一部分。巨噬細

30、胞功能檢測部分，分別提取野生型 C57BL/6小鼠和髓系細胞高表達 TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓來源巨噬細胞（ bone marrow-derived macrophage, BMMs）和腹腔巨噬細胞（peritoneal macrophages, PMs），分組如下：PMs分組：Control/WT組、LPS+IFN-γ/WT組、Control/Tg組、LPS+IFN-γ/Tg組，其中Control組為提取出 PMs后用含10%胎牛血清的

31、 DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h；LPS+IFN-γ組為提取出PMs后用含100 ng/mL脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）和25 ng/mL干擾素-γ（interferon, IFN-γ）培養(yǎng)72 h；BMMs分組：Control/WT組、M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組、Control/Tg組、M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組，首先提取出骨髓造血干細胞，應用含10 ng/mL巨噬細胞集落刺激因子（

32、macrophage colony stimulating factor, M-CSF）的10%胎牛血清DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)9天誘導分化為巨噬細胞，Control組為繼續(xù)應用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，M-CSF+LPS+IFN-γ組為應用含10 ng/mL M-CSF、100 ng/mL LPS和25 ng/mL IFN-γ的10%胎牛血清DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。收集上述分組中的巨噬細胞培養(yǎng)基用于細胞因子檢測和作為干預HSCs的

33、條件培養(yǎng)基（conditioned medium, CM）。應用原位循環(huán)灌流和密度梯度離心技術分離野生型小鼠HSCs，用BMMs和PMs的條件養(yǎng)基干預，實驗分組如下。PMs的CM干預HSCs分組：Control組（用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs24 h）；LPS+IFN-γ組（用含40 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-γ的10%胎牛血清DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs24 h）；CM/WT組（用含40%野生型

34、小鼠PMs CM的10%胎牛血清DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs24 h）；CM/Tg組（用含40%轉(zhuǎn)基因小鼠PMs CM的10%胎牛血清DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs24 h）。BMMs的CM干預HSCs分組：Control組（用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs24 h）；M-CSF+LPS+IFN-γ組（用含4 ng/mL M-CSF、40 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-γ的10%胎牛血清DMEM細胞培養(yǎng)基

35、培養(yǎng)HSCs24 h）；CM/WT組（用含40%野生型小鼠BMMs CM的10%胎牛血清DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs24 h）；CM/Tg組（用含40%轉(zhuǎn)基因小鼠BMMs CM的10%胎牛血清 DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng) HSCs24 h）。應用免疫組織化學染色和Real time Q-PCR方法檢測肝組織中 F4/80表達。Real time Q-PCR和Western blot方法檢測肝組織中C-C趨化因子配體2（C–C chemok

36、ine ligand2, CCL2）表達。應用ELISA方法檢測血清、巨噬細胞培養(yǎng)基，Real time Q-PCR方法檢測肝組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor beta, TGF-β1）、血小板衍生生長因子-BB（platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）和白介素-1β（

37、interleukin-1β, IL-1β）表達。Real time Q-PCR和Western blot方法檢測HSCs中 Collagen1α1、MMP-13和組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1, TIMP-1）表達。
　　結果：1) Real time Q-PCR檢測肝組織中F4/80 mRNA的相對表達量， Control/WT組（1±

38、0.12）、Oil/WT組（1.16±0.22）、Control/Tg組（1.23±0.2）和Oil/Tg組（1.3±0.18）之間差異均無統(tǒng)計學意義，P>0.05；CCl4/WT組（3.95±0.9）較Oil/WT組F4/80 mRNA的相對表達量明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（6.3±0.95 vs3.95±0.9, P<0.05）。免疫組織化學染色方法檢測各組 F4/80表達，Control/W

39、T組、Oil/WT組、Control/Tg組和 Oil/Tg組 F4/80陽性染色面積依次為：0.98%±0.23%、1.03%±0.31%、1.02%±0.16%、1%±0.29%，各組間差異均無統(tǒng)計學意義， P>0.05；CCl4/WT組陽性染色面積（3.7%±1.1%）顯著高于Oil/WT組， P<0.01；且CCl4/Tg組的陽性染色面積顯著高于CCl4/WT組（6.52%±1.74%vs3.7%±1.1%, P<0.01）。2

40、) Real time Q-PCR和Western blot方法檢測肝組織中CCL2表達，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間差異均無統(tǒng)計學意義，P>0.05；CCl4/WT組（5.7±1.6）較Oil/WT組（1.17±0.37）CCL2 mRNA的相對表達量明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（10.74±2.87 vs5.7±1.6, P<0.05）。CC

41、L2蛋白在CCl4/WT組（1.25±0.12）較Oil/WT組（0.85±0.07）表達量明顯升高， P<0.01；CCl4/Tg組較 CCl4/WT組明顯升高（1.81±0.16 vs1.25±0.12, P<0.01）。3)成功提取小鼠骨髓造血干細胞，并誘導分化為巨噬細胞，成功提取并純化小鼠腹腔巨噬細胞；通過LPS聯(lián)合IFN-γ促進巨噬細胞活化，從而獲得活化的高表達 TL1A巨噬細胞和野生型巨噬細胞。4) ELISA方法檢測血清中

42、 TGF-β1含量、Real time Q-PCR檢測肝組織中TGF-β1 mRNA的表達，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間差異均無統(tǒng)計學意義，P>0.05；血清TGF-β1含量在CCl4/WT組（184 pg/ml±17.3 pg/ml）較Oil/WT組（89.1 pg/ml±7.4 pg/ml）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較 CCl4/WT組明顯升高（253.6 pg/m

43、l±11.4 pg/ml vs184pg/ml±17.3 pg/ml, P<0.01）。肝組織中TGF-β1 mRNA的表達在CCl4/WT組（3.83±1.23）較 Oil/WT組（1.22±0.33）明顯升高，P<0.05；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（6.45±1.35 vs3.83±1.23, P<0.05）。ELISA方法檢測 BMMs上清液中 Control/WT組、 Control/Tg組、M-CSF+LPS

44、+IFN-γ/WT組、M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組TGF-β1含量依次為2679.73 pg/ml±167.01 pg/ml、2495.08 pg/ml±264.47 pg/ml、2515.08 pg/ml±164.47 pg/ml、2572.08 pg/ml±216.35 pg/ml，4組間差異均無統(tǒng)計學意義，P>0.05。檢測PMs上清液中TGF-β1含量，與BMMs結果趨勢一致。5)采用ELISA方法檢測血清中PDGF-

45、BB含量、Real time Q-PCR檢測肝組織中 PDGF-BB mRNA的表達， Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和 Oil/Tg組之間差異均無統(tǒng)計學意義， P>0.05；血清PDGF-BB含量在CCl4/WT組（2253.2 pg/ml±297.4 pg/ml）較Oil/WT組（601.7 pg/ml±121.7 pg/ml）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（300

46、8.7 pg/ml±295.9 pg/ml vs2253.2 pg/ml±297.4 pg/ml, P<0.01）。PDGF-BB mRNA的相對表達量在CCl4/WT組（2.04±0.57）較Oil/WT組（1.07±0.14）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（3.04±0.33 vs2.04±0.57, P<0.01）。ELISA方法檢測BMMs培養(yǎng)液上清中PDGF-BB含量，Control/WT組

47、（7838.38 pg/ml±882.11 pg/ml）與Control/Tg組（8320.44 pg/ml±1038.59 pg/ml）相比無明顯差異，P>0.05；而 M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組比 M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組明顯升高（15447.36 pg/ml±1129.50 pg/ml vs11464.79 pg/ml±1402.97 pg/ml, P<0.01）。檢測PMs上清液中PDGF-BB含量，與

48、BMMs結果趨勢一致。6)采用ELISA方法檢測血清中TNF-α含量、Real time Q-PCR檢測肝組織中TNF-αmRNA的表達，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間差異均無統(tǒng)計學意義，P>0.05；TNF-α含量在CCl4/WT組（61.2 pg/ml±11.8 pg/ml）較Oil/WT組（26.9 pg/ml±5.8 pg/ml）明顯升高， P<0.01；CCl4/Tg組較CC

49、l4/WT組明顯升高（104 pg/ml±18.4 pg/ml vs61.2 pg/ml±11.8 pg/ml, P<0.01）。TNF-α mRNA的相對表達量在CCl4/WT組（4.97±0.8）較Oil/WT組（1.09±0.4）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（8.8±2.5 vs4.97±0.8, P<0.05）。應用ELISA方法檢測 BMMs上清液中 TNF-α含量， Control/WT

50、組、Control/Tg組、M-CSF+LPS+ IFN-γ/WT組、M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組依次為182.19 pg/ml±54.74 pg/ml、195.33 pg/ml±45.57 pg/ml、4128.07 pg/ml±331.40 pg/ml、4613.5 pg/ml±238.15 pg/ml，其中Control/Tg組略高于Control/WT組，但差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05；M-CSF+LPS+IFN-γ

51、/WT組明顯高于Control/WT組，P<0.01；M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組明顯高于M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組（4613.5 pg/ml±238.15 pg/ml vs4128.07 pg/ml±331.40 pg/ml, P<0.05）。檢測PMs上清液中TNF-α含量，與BMMs結果趨勢一致。7)采用ELISA方法檢測血清中IL-1β含量、Real time Q-PCR檢測肝組織中pro-IL-1β mR

52、NA的表達，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間差異均無統(tǒng)計學意義，P>0.05；血清中IL-1β含量在CCl4/WT組（43.5 pg/ml±9.1 pg/ml）較Oil/WT組（29.3 pg/ml±4.7 pg/ml）明顯升高，P<0.05；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（64.6 pg/ml±11.3 pg/ml vs43.5 pg/ml±9.1 pg/ml, P<0.0

53、1）。Pro-IL-1βmRNA的相對表達量在CCl4/WT組（4.89±0.68）較Oil/WT組（1.12±0.4）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（5.93±0.55 vs4.89±0.68, P<0.05）。應用ELISA方法檢測 BMMs培養(yǎng)液上清中 IL-1β含量， Control/WT組（34.57 pg/ml±3.11 pg/ml）與Control/Tg組（36.62 pg/ml±3.5

54、4 pg/ml）相比無顯著性差異，P>0.05；而M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組比M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組增加明顯（121.08 pg/ml±6.68 pg/ml vs94.10 pg/ml±5.19 pg/ml, P<0.01）。檢測PMs上清液中IL-1β含量，與BMMs結果趨勢一致。8)應用原位灌注、密度梯度離心法分離小鼠原代HSCs，熒光顯微鏡（波長328 nm）觀察可見初分離的小鼠原代HSCs由于富含維生

55、素 A脂滴，呈自發(fā)藍綠色熒光；應用Desmin免疫熒光染色鑒定分離出的HSCs，在倒置熒光顯微鏡下陽性細胞胞漿內(nèi)可見綠色熒光，Desmin染色陽性率約93%。9)應用BMMs條件培養(yǎng)基干預原代HSCs24 h后，Real time Q-PCR和Western blot方法檢測HSCs中Collagen1α1的表達，M-CSF+LPS+IFN-γ組與Control組之間差異均無統(tǒng)計學意義， P>0.05；CM/WT組（1.88±0.14）

56、較M-CSF+LPS+IFN-γ組（1.06±0.08）Collagen1α1 mRNA的相對表達量明顯升高，P<0.01；CM/Tg組中Collagen1α1 mRNA的相對表達量較CM/WT組明顯升高（2.65±0.18 vs1.88±0.14, P<0.01）。CM/WT組Collagen1α1蛋白定量（0.74±0.07）較M-CSF+LPS+IFN-γ組（0.53±0.05）明顯升高，P<0.01；CM/Tg組Collagen

57、1α1蛋白定量較CM/WT組明顯升高（0.96±0.14 vs0.74±0.07, P<0.01）。應用 PMs條件培養(yǎng)基干預后檢測 HSCs中Collagen1α1表達趨勢與BMMs相一致。10)應用BMMs條件培養(yǎng)基干預原代HSCs24 h后，Real time Q-PCR和Western blot方法檢測HSCs中MMP-13的表達，M-CSF+LPS+IFN-γ組與 Control組之間差異均無統(tǒng)計學意義，P>0.05；CM/W

58、T組的MMP-13 mRNA相對表達量（0.84±0.12）明顯低于M-CSF+LPS+IFN-γ組（1.03±0.04），P<0.05；CM/Tg組中MMP-13 mRNA的相對表達量（0.77±0.08）與CM/WT組相比差異無統(tǒng)計學意義， P>0.05。CM/WT組中 MMP-13蛋白表達量（0.35±0.06）比M-CSF+LPS+IFN-γ組（0.46±0.03）明顯下降，P<0.01；CM/Tg組中MMP-13蛋白表達量（0

59、.37±0.04）與CM/WT組之間差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。應用PMs條件培養(yǎng)基干預后檢測HSCs中MMP-13表達，趨勢與BMMs相一致。11)應用BMMs條件培養(yǎng)基干預原代HSCs24 h后，Real time Q-PCR和 Western blot方法檢測 HSCs中 TIMP-1的表達， M-CSF+LPS+IFN-γ組與 Control組之間差異均無統(tǒng)計學意義，P>0.05；CM/WT組的 TIMP-1 mRNA相對表

60、達量（1.79±0.07）明顯高于M-CSF+LPS+IFN-γ組（1.04±0.05），P<0.01；CM/Tg組中TIMP-1 mRNA的相對表達量較CM/WT組明顯升高（2.14±0.16 vs1.79±0.07, P<0.01）。CM/WT組中 TIMP-1蛋白表達量（0.62±0.1）比 M-CSF+LPS+IFN-γ組（0.35±0.06）明顯升高， P<0.01；CM/Tg組中 TIMP-1蛋白表達量較CM/WT組明顯升高

61、（0.85±0.12 vs0.62±0.1, P<0.01）。應用PMs條件培養(yǎng)基干預后檢測HSCs中TIMP-1表達，趨勢與BMMs相一致。
　　第三部分髓系細胞高表達TL1A在實驗性小鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中的作用
　　目的：探討髓系細胞高表達TL1A對小鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)、血管生成及巨噬細胞募集的影響。
　　方法：將Tg小鼠與WT小鼠隨機分為Oil/WT組（每周2次腹腔注射橄欖油溶液5μL·g-1，持續(xù)6周）、CCl46

62、 wk/WT組（每周2次腹腔注射10%CCl4橄欖油溶液5μL·g-1，持續(xù)6周）、CCl4 Re1 wk/WT組（完成上述肝纖維化造模后停藥恢復1周，分組中用Re代替逆轉(zhuǎn)reversion）、CCl4 Re2 wk/WT組（完成上述肝纖維化造模后停藥恢復2周）、Oil/Tg組（處理方式同Oil/WT組）、CCl46 wk/Tg組（處理方式同CCl46 wk/WT組）、CCl4 Re1 wk/Tg組（處理方式同CCl4 Re1 wk/W

63、T組）、CCl4 Re2 wk/Tg組（處理方式同CCl4 Re2 wk/WT組），每組各10只。應用天狼猩紅染色和羥脯氨酸檢測了解纖維組織降解情況；免疫組織化學染色、Real time Q-PCR和Western blot方法檢測肝組織Collagen1α1表達；免疫熒光法和 Western blot方法檢測血小板內(nèi)皮細胞粘附分子1（ Platelet endothelial cell adhesion molecule1, PECA

64、M-1）也稱為分化抗原簇31（cluster of differentiation31, CD31）表達；免疫組織化學法檢測肝組織中F4/80表達；Real time Q-PCR和Western blot方法檢測肝組織中MMP-13和TIMP-1表達。
　　結果：1)天狼猩紅染色后統(tǒng)計各組中纖維結締組織所占面積百分比， Oil/WT組與 Oil/Tg組之間差異無統(tǒng)計學意義（0.27%±0.06% vs0.25%±0.08%, P＞

65、0.05）；CCl46 wk/Tg組、CCl4 Re1 wk/Tg組和CCl4 Re2 wk/Tg組均明顯高于相對應的CCl46 wk/WT組、CCl4 Re1 wk/WT組和CCl4 Re2 wk/WT組；CCl4 Re1 wk/Tg組天狼猩紅染色陽性面積百分比較CCl46 wk/Tg組下降約1.07%，CCl4 Re1 wk/WT組較CCl46 wk/WT組下降約1.08%；CCl4 Re2 wk/Tg組天狼猩紅染色陽性面積百分比較

66、CCl4 Re1 wk/Tg組下降約0.52%，CCl4 Re2 wk/WT組天狼猩紅染色陽性面積百分比較CCl4 Re1 wk/WT組下降約0.83%。檢測各組羥脯氨酸含量，Oil/WT組與Oil/Tg組之間差異無統(tǒng)計學意義（92μg/g±10μg/g vs89μg/g±7μg/g, P＞0.05）；CCl46 wk/Tg組、CCl4 Re1 wk/Tg組和CCl4 Re2 wk/Tg組均明顯高于相對應的CCl46 wk/WT組、CC

67、l4 Re1 wk/WT組和CCl4 Re2 wk/WT組；CCl4 Re1 wk/WT組羥脯氨酸含量較CCl46 wk/WT組下降約23μg/g，而CCl4 Re1 wk/Tg組較CCl46 wk/Tg組下降約17μg/g；CCl4 Re2 wk/WT組羥脯氨酸含量較CCl4 Re1 wk/WT組下降約42μg/g，而CCl4 Re2 wk/Tg組較CCl4 Re1 wk/Tg組下降約31μg/g。2)應用免疫組織化學染色、Real

68、time Q-PCR和Western blot方法檢測肝組織中Collagen1α1表達，結果發(fā)現(xiàn)Oil/WT組與Oil/Tg組之間差異無統(tǒng)計學意義；CCl46 wk/Tg組、CCl4 Re1 wk/Tg組和CCl4 Re2 wk/Tg組中Collagen1α1表達均明顯高于相對應的CCl46 wk/WT組、CCl4 Re1 wk/WT組和CCl4 Re2 wk/WT組。3)免疫組織熒光染色和Western blot檢測CD31表達，O

69、il/Tg組、CCl46 wk/Tg組、CCl4 Re1 wk/Tg組和CCl4 Re2 wk/Tg組中CD31表達均明顯低于相對應的Oil/WT組、CCl46 wk/WT組、CCl4 Re1 wk/WT組和CCl4 Re2 wk/WT組。4)免疫組織化學染色檢測肝組織中F4/80表達，Oil/Tg組與Oil/WT組之間F4/80陽性染色面積差異無統(tǒng)計學意義（1.13%±0.37%vs1.15%±0.4%, P＞0.05）；CCl46

70、wk/Tg組與CCl46 wk/WT組之間差異無統(tǒng)計學意義（3.22%±0.27%vs2.82%±0.36%, P＞0.05）；CCl4 Re1 wk/Tg組F4/80陽性染色面積明顯低于CCl4 Re1 wk/WT組（4.04%±0.47% vs5.98%±1.32%, P＜0.05）；CCl4 Re2 wk/Tg組F4/80陽性染色面積明顯低于CCl4 Re2 wk/WT組（1.91%±0.29%vs2.32%±0.22%, P＜0

71、.05）。5) Real time Q-PCR和Western blot技術檢測各組中MMP-13表達，Oil/WT組與Oil/Tg組之間無統(tǒng)計學差異，P＞0.05；CCl46 wk/Tg組與CCl46 wk/WT組相比差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05；MMP-13 mRNA在CCl4 Re1 wk/Tg組明顯低于CCl4 Re1 wk/WT組（3.58±0.4 vs4.54±0.43, P＜0.01）；MMP-13 mRNA在CCl4

72、Re2 wk/Tg組明顯低于CCl4 Re2 wk/WT組（1.85±0.3 vs2.28±0.24, P＜0.05）。MMP-13蛋白檢測與上述檢測結果趨勢一致。6)采用Real time Q-PCR檢測各組中TIMP-1 mRNA表達，Oil/WT組與Oil/Tg組之間差異無統(tǒng)計學意義（1.03±0.33 vs0.95±0.04, P＞0.05）；CCl46 wk/Tg組TIMP-1 mRNA相對表達量明顯高于CCl46 wk/WT

73、組（5.21±0.53 vs4.14±0.56, P＜0.01）；CCl4 Re1 wk/Tg組TIMP-1 mRNA相對表達量明顯高于CCl4 Re1 wk/WT組（4.12±0.62 vs3±0.44, P＜0.01）；CCl4 Re2 wk/Tg組TIMP-1 mRNA相對表達量明顯高于CCl4 Re2 wk/WT組（2.39±0.54 vs1.6±0.17, P＜0.05）。Western blot技術檢測各組中TIMP-1蛋白

74、表達，結果顯示：Oil/Tg組與 Oil/Tg組之間差異無統(tǒng)計學意義（0.32±0.05 vs0.35±0.06, P＞0.05）；CCl46 wk/Tg組TIMP-1蛋白表達明顯高于CCl46 wk/WT組（0.92±0.1 vs0.64±0.06, P＜0.01）；CCl4 Re1 wk/Tg組TIMP-1蛋白表達明顯高于CCl4 Re1 wk/WT組（0.78±0.07 vs0.47±0.05, P＜0.01）；CCl4 Re2

75、wk/Tg組 TIMP-1蛋白表達明顯高于 CCl4 Re2 wk/WT組（0.55±0.1 vs0.38±0.06, P＜0.01）。
　　結論：
　　1在 CCl4誘導的實驗性小鼠肝纖維化模型肝組織中和巨噬細胞內(nèi)TL1A表達明顯升高。
　　2在肝纖維化發(fā)生過程中，髓系細胞高表達TL1A可促進巨噬細胞向肝臟募集，加重肝功能損傷、肝細胞壞死和凋亡；上調(diào)肝組織中TGF-β1、PDGF-BB、TNF-α和IL-1β表達，從