氨基胍對豬DCD供胰的功能保護作用的實驗研究背景及目的.pdf

1、糖尿病是血中胰島素絕對或相對不足，導(dǎo)致血糖過高，出現(xiàn)糖尿，進(jìn)而引起脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂，可出現(xiàn)諸多臨床上表現(xiàn)多尿、煩渴、多飲、多食，消瘦等，嚴(yán)重者容易發(fā)生酮癥酸中毒等急性并發(fā)癥或血管、神經(jīng)等慢性并發(fā)癥。糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，目前全世界糖尿病患者已超過2億人，是嚴(yán)重危害人類健康的常見病之一。2000年Edmonton方案的成功，標(biāo)志著胰島移植取得了突破性的進(jìn)展。但是分離大量高純度胰島仍有一定困難，而且胰島在分離過程中其生存微

2、環(huán)境遭到破壞，移植到體內(nèi)后缺血缺氧、炎癥和免疫排斥反應(yīng)等不利因素使大量胰島細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡，這些因素都導(dǎo)致從單個供體胰腺獲取的胰島數(shù)量遠(yuǎn)不能滿足一個受體的需求。
　　 一氧化氮合酶(NOS)是一種同工酶，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)。其有三種亞型:神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)。一氧化氮合酶(NOS)存在于多種細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)吞噬細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞中。由于一氧化氮極

3、為不穩(wěn)定，所以現(xiàn)階段轉(zhuǎn)而研究生成一氧化氮的酶。隨著一氧化氮合酶拮抗劑的問世，大大方便了我們對一氧化氮功能的研究。
　　 研究表明，在細(xì)胞因子的刺激下，原本在生理狀態(tài)下很少表達(dá)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)可大量產(chǎn)生，催化合成過量的一氧化氮(N0)。高濃度的NO是胰島β細(xì)胞損傷的效應(yīng)因子，并轉(zhuǎn)化為自由基，進(jìn)而對β細(xì)胞有嚴(yán)重?fù)p害，破壞胰島素的分泌，已經(jīng)被認(rèn)為是糖尿病的發(fā)病機制之一。
　　 本研究使用特異性的iNOS抑制劑氨

4、基胍(aminoguanidine)加入到機械灌注液中抑制胰島組織中iNOS的活性，阻止NO的過量產(chǎn)生，對胰島細(xì)胞進(jìn)行保護，改善胰島的存活與功能。
　　 方法:
　　 一、豬DCD胰島的分離和純化
　　 豬DCD胰島分離:先進(jìn)性37℃水浴消化12-15分鐘，間斷振蕩離心管。消化過程中密切觀察胰腺消化情況，當(dāng)胰腺消化產(chǎn)物呈現(xiàn)“小米粥”外觀時，迅速加入50ml冷Hank's液并冰浴，終止消化。采用不連續(xù)密度梯度離心，

5、介質(zhì)為Ficoll和Hank's液的混合物，濃度分別為25％、23％、20.5％、11％。
　　 二、檢測NO和iNOS
　　 利用NO試劑盒，通過硝酸還原酶法檢測培養(yǎng)液NO水平，NOS試劑盒檢測胰島組織iNOS活性。
　　 三、胰島活性鑒定
　　 采用AO/PI熒光染色法判定胰島細(xì)胞活性。在熒光顯微鏡下用490 nm激發(fā)光濾光片、510 nm光柵濾光片可同時見到綠色(AO)和紅色(PI)熒光，綠色標(biāo)記的

6、為活細(xì)胞，紅色標(biāo)記的為死細(xì)胞。計算胰島細(xì)胞活性。
　　 四、胰島功能檢測
　　 采用葡萄糖刺激胰島素分泌實驗評價胰島細(xì)胞功能。計數(shù)20IEQ胰島細(xì)胞，用含有2.8mmol/L和16.7mmol/L葡萄糖的Kreb's-Hank's液（含有10mmol／LHEPES和0.5％BSA）分別孵育2h和1h，分別收集第2h和3h的培養(yǎng)液上清采用ELISA法測定胰島素含量。計算胰島素釋放指數(shù)(SI):SI=第3h（高糖環(huán)境）的胰島

7、素含量／第2h（低糖環(huán)境）的胰島素含量（＞3為功能正常）。
　　 五、統(tǒng)計學(xué)處理
　　 結(jié)果以means±SD表示，組間比較采用t檢驗或方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)均由SPSS17.0軟件處理。
　　 結(jié)果:
　　 一、胰島獲得量、純度及活性
　　 采用明尼蘇達(dá)大學(xué)改良法，機械灌注不同時間平均每只豬可獲得約1700-3100IEQ/g胰島，STZ染色提示純度為53-74％，

8、AO/EB熒光染色顯示胰島活性為38-67％。
　　 二、機械灌注液中NO水平及胰島組織中iNOS活性
　　 新分離的胰島中iNOS活性較低，測得的NO含量也較少。當(dāng)用細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α處理胰島后，測得的iNOS和NO濃度明顯增加。當(dāng)氨基胍和細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α同時加入灌注液時，測得的iNOS和NO濃度又明顯降低，說明氨基胍使iNOS和NO的活性均受到抑制。
　　 三、胰島活性
　　

9、 當(dāng)用細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α處理胰島后，AO/EB染色顯示大量死亡的胰島細(xì)胞。而當(dāng)氨基胍和細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α處理胰島后，AO/EB染色顯示有大量活的胰島。
　　 四、胰島功能
　　 新分離的胰島基礎(chǔ)胰島素分泌量和胰島素釋放指數(shù)均較正常，當(dāng)用細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α處理胰島后，胰島功能受到破壞，基礎(chǔ)胰島素分泌量和胰島素釋放指數(shù)下降明顯。而當(dāng)氨基胍和細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α處理胰島后，胰島功能