脂肪酶產(chǎn)生菌的細(xì)胞融合選育及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化.pdf

1、脂肪酶(Lipase)是一種特殊的酯鍵水解酶,它可作用于甘油三酯的酯鍵,使甘油三脂降解為甘油二酯、單甘油酯、甘油和脂肪酸。脂肪酶是最早被人們研究的酶類之一,也是一種重要的工業(yè)用酶,被廣泛應(yīng)用于輕工領(lǐng)域。微生物脂肪酶被發(fā)現(xiàn)以來,由于其種類多,高度的底物專一性,寬范圍的作用pH和溫度,容易工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn),選育脂肪酶高產(chǎn)菌株成了國內(nèi)外相關(guān)研究的熱點(diǎn)。
　　 本文利用化學(xué)PEG融合法使白地霉(Geotrichum candidum

2、 NS3)原生質(zhì)體和假絲酵母(Candida valida T2)原生質(zhì)體融合,結(jié)合抗藥性標(biāo)記篩選方法,成功篩選出一株產(chǎn)脂肪酶能力較高并且生長(zhǎng)能力較強(qiáng)的融合菌株,并對(duì)融合株的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶條件進(jìn)行初步研究。主要研究工作和結(jié)果如下:
　　 (1)脂肪酶雙親本菌株抗藥性標(biāo)記的選擇。實(shí)驗(yàn)利用藥物濃度梯度平板法和醫(yī)學(xué)給藥原則,選用12種藥物分別對(duì)白地霉(Geotrichum candidum NS3)和假絲酵母(Candida val

3、ida T2)進(jìn)行抗藥性測(cè)定,成功篩選出白地霉和假絲酵母的抗藥性標(biāo)記。白地霉抗性而假絲酵母非抗性的藥物標(biāo)記為曲咪新乳膏濃度為2×103μg/ml,假絲酵母抗性而白地霉非抗性的藥物標(biāo)記則為硫酸銅濃度為2×103μg/=ml。
　　 (2)雙親本菌株原生質(zhì)體制備和再生條件的研究。利用單因素實(shí)驗(yàn)探討影響白地霉和假絲酵母原生質(zhì)體形成率和再生率的各種因素,結(jié)果表明制備原生質(zhì)體的優(yōu)化條件為:雙親本菌齡為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期、1.5％的纖維素酶酶解1

4、小時(shí)、酶解溫度30℃、脫壁促進(jìn)劑為0.05％的半胱氨酸、滲透壓穩(wěn)定劑為0.7 M NaCl。
　　 (3)雙親本原生質(zhì)體融合及融合子的鑒定。利用化學(xué)PEG方法使雙親本原生質(zhì)體融合,通過影印法篩選得到50株融合子。連續(xù)傳代10次,獲得8株性狀穩(wěn)定的融合子,再通過油脂同化平板法篩選得到一株融合菌株,命名為CG16。通過比較雙親本及融合子CG16的菌落表型、顯微結(jié)構(gòu),以及對(duì)融合子CG16全細(xì)胞可溶性蛋白電泳分析,結(jié)果表明融合子CG16

5、是由雙親本原生質(zhì)體融合得到的新菌株。
　　 (4)融合子CG16固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶條件初步優(yōu)化研究。通過單因素比較實(shí)驗(yàn),對(duì)融合子CG16進(jìn)行了固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵培養(yǎng)條件的初步優(yōu)化。結(jié)果表明固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化培養(yǎng)基為:12 g固體物質(zhì)(麥麩:大豆粉=3:2),8 ml營養(yǎng)鹽溶液(g/L:KH2PO47.07,Na2HPO422.06,MgSO4·7H2O2.0,Na2CO32.0,Na.NO37.07)；發(fā)酵條件為:接種量為2％