產(chǎn)脂肪酶菌株Serratia marcescens Lipa1318的分離鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及其脂肪酶基因的克隆表達.pdf

1、脂肪酶在食品、藥品、洗滌劑、化妝品和生物柴油合成等領域擁有廣泛的用途，并且備受人們關注。發(fā)掘具有脂肪酶高產(chǎn)潛力的微生物資源及其基因資源并加以開發(fā)利用對脂肪酶的酶學研究和實際應用具有重要的意義。
　　本文主要進行了以下方面的研究:
　　(1)產(chǎn)脂肪酶菌株Serratia marcescens Lipa1318篩選和鑒定:采用吐溫平板與橄欖油油脂板結合的方法從采集自河北省各地油污豐富的122份土樣中初步篩選到57株脂肪酶產(chǎn)生菌。

2、用p-NPP法復篩獲得一株高產(chǎn)脂肪酶的菌株Lipa1318，酶活達到2.56U/mL。通過對該菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特征及主要生理生化特征的鑒定確認其是粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens);PCR擴增得到該菌株1535 bp長的16S rDNA保守序列，與NCBI公布的16S rDNA序列進行比對分析，并通過MEGA4.1軟件構建系統(tǒng)進化樹最終確定該菌株為S.marcescens，故將該菌株命名為S.marcescens Li

3、pa1318。對菌株Lipa1318粗酶液的最適溫度、最適pH值及溫度和pH值穩(wěn)定性的研究結果表明該菌株脂肪酶的最適反應溫度為60℃，最適pH為8.0，此條件下酶活為3.56 U/mL。該酶在50℃下保溫1h后酶活保持約90％;在pH值5.0～11.0之間，30℃保溫2.5 h后，酶活仍保持70％，說明該酶是一種耐熱堿性脂肪酶，且具有良好的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性。
　　(2)S.marcescens Lipa1318產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件

4、優(yōu)化:通過單因子試驗及響應面設計軟件Design-Expert V8.0.6.1對菌株S.marcescens Lipa1318進行產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。結果顯示該菌株的最適產(chǎn)酶條件為:在含1.0％的牛肉膏、0.31％的葡萄糖、0.15％酵母粉、0.54％ TritonⅩ-100、0.50 mmol/L Ca2+、初始pH8.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按4％接種量接種于裝液量為60 mL的300 mL三角瓶中，30℃發(fā)酵培養(yǎng)96 h，最高酶活可達（1

5、3.95±0.07）U/mL。按照上述培養(yǎng)條件對菌株Lipa1318進行10L發(fā)酵試驗，發(fā)酵液酶活力提高到25.32 U/mL，較搖瓶發(fā)酵的酶活提高了近2倍。
　　(3)S.marcescens Lipa1318脂肪酶基因的克隆和表達:根據(jù)GenBank中已知的S.marcescens脂肪酶基因序列設計相應引物，成功克隆了S.marcescens Lipa1318的脂肪酶基因并命名為lipA，GenBank登錄號為KJ669102

6、。lipA長1845 bp，同源序列比對結果表明lipA基因與其他S.marcescens菌株公布的脂肪酶基因同源性高達94-99％; lipA基因編碼614個氨基酸，分子量為65 kDa，與其他S.marcescens菌株公布的脂肪酶至少有2個氨基酸的差異。通過軟件成功對該脂肪酶蛋白的二級和三級結構進行預測，結果發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的中后段即第484-539個氨基酸殘基處為該蛋白的保守區(qū)。將lipA基因分別插入表達載體pET-21b及pET-