酯合成脂肪酶高產(chǎn)菌的選育及其產(chǎn)酶發(fā)酵調(diào)控的研究.pdf

1、非水相中脂肪酶催化的酯合成反應已廣泛用于各種酯的合成，并且也成為近二十年來脂肪酶催化的研究熱點。由于并不是所有的脂肪酶都能催化非水相中的酯化反應，造成了現(xiàn)有脂肪酶中能有效催化酯合成反應的酶并不多，必須開發(fā)新的具有高酯合成活性的脂肪酶。 本文以獲得高酯活性脂肪酶為目標，首先建立了一種能快速篩選具有酯合成能力脂肪酶的篩選和酶活測定方法，然后以一株根霉RhizopuschinensisY92為出發(fā)菌，采用離子束和亞硝基胍進行誘變，以建

2、立的方法進行初篩，最終篩選得到一株脂肪酶高產(chǎn)菌R.chinensisY92-M，并對其培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。深入研究了影響具有酯合成活性脂肪酶合成的主要因素，并對該菌所產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶進行了詳細分析，揭示了全細胞脂肪酶水解與合成活力之間的關系，找到了控制酯合成活性脂肪酶大量合成的手段。針對絲狀真菌形態(tài)變化對生產(chǎn)的影響，詳細研究了搖瓶和發(fā)酵罐中形態(tài)變化對酶合成的影響。并將全細胞脂肪酶用于酯的合成和生物柴油的生產(chǎn)，具體內(nèi)容和結(jié)果： (1)

3、為了能篩選得到酯合成活性高的脂肪酶生產(chǎn)菌，本文建立了一種非水相中用于具有合成活性脂肪酶篩選和活力測定的新方法。該方法的原理是利用脂肪酶在正庚烷中催化對硝基苯酚棕櫚酸酯(pNPP)和乙醇之間的轉(zhuǎn)酯化反應，然后用NaOH溶液快速萃取生成的對硝基苯酚并在410nm檢測吸光度。該法與其它已經(jīng)報道的類似方法相比，所需儀器簡單，底物廉價，操作簡單，因此篩選效率得到了有效提高。 (2)以R.chinensisY92為出發(fā)菌，采用兩輪離子束注入

4、誘變，并結(jié)合亞硝基胍誘變，以所建立的方法作為初篩方法，以氣相測定酯合成能力作為復篩方法，篩選得到一株酯合成活性顯著提高的菌株R.chinensisY92-M，該菌單位菌體的合成活性由200U/g，提高到400U/g。 (3)為了進一步提高該菌的產(chǎn)酶能力，對培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。首先采用田口設計對培養(yǎng)條件進行了初步優(yōu)化，對四個培養(yǎng)基組成因素(麥芽糖、橄欖油、蛋白胨、和K2HPO4)和四個環(huán)境因素(搖床轉(zhuǎn)速、接種量、pH和裝液量)進行

5、了考察，結(jié)果分析表明環(huán)境因素對產(chǎn)酶影響更顯著。通過響應面對培養(yǎng)條件進一步優(yōu)化得到最優(yōu)培養(yǎng)條件：接種量4.25×108spores/L，橄欖油2.37％(w/v)，裝液量21mL/250mL，蛋白胨4.06％(w/v)，麥芽糖0.5％(w/v)，K2HPO40.3％(w/v)，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，pH5.5。預測全細胞脂肪酶的最大酶活產(chǎn)率為14349.2U/L，驗證性實驗在最優(yōu)條件下，R.chinensisY92-M產(chǎn)具有酯合成活性

6、全細胞脂肪酶可達13875U/L。 (4)通過培養(yǎng)基中添加不同類型、不同量的脂肪酸或脂肪酸酯，考察了發(fā)酵過程中全細胞脂肪酶水解活性與合成活性的關系。結(jié)果表明，全細胞的水解活性受各種脂肪酸和脂肪酸酯的誘導作用并不明顯，而碳鏈大于18的脂肪酸或者脂肪酸酯對全細胞合成活性有顯著的誘導作用，最高酶活力是未加油脂的培養(yǎng)基條件的17倍。 (5)對細胞各部分的蛋白組分的分析結(jié)果表明，胞內(nèi)脂肪酶具有水解活性而不具備合成活性。膜結(jié)合蛋白具

7、有很好的酯合成活性，同時也具有水解活性。該微生物對具有酯合成活性脂肪酶的調(diào)節(jié)既表現(xiàn)在酶量的調(diào)節(jié)，也表現(xiàn)在酶活性的調(diào)節(jié)。酶量的調(diào)節(jié)體現(xiàn)在具有酯合成活性的脂肪酶為典型的誘導型酶：當誘導物三甘酯添加量大于20g/L時，能維持酶活在650U/g，當誘導物量不足時酶活迅速下降；具有合成活性脂肪酶的高產(chǎn)的條件除必須有油脂添加外，細胞還必須與油脂充分接觸，解除這種接觸狀態(tài)，酶的合成即停止。酶活性的調(diào)節(jié)則體現(xiàn)在全細胞水解活力的變化上：具有高合成活性的全

8、細胞的水解活性并不高，而實際上具有合成活性的膜結(jié)合脂肪酶水解活力可達56U/mg。對不同培養(yǎng)時間的細胞各部分的蛋白組分的分析，推測造成全細胞表觀水解活力和合成活力不對應的原因是膜結(jié)合脂肪酶存在變構(gòu)調(diào)節(jié)。 (6)研究了不同三油酸甘油酯添加量對產(chǎn)酶的影響，提出了油脂流加策略。搖瓶中采用油脂流加方式也可以使得酶活力保持在650U/g，酶活產(chǎn)率13000U/L肌左右，而油脂總添加量只需15g/L。發(fā)酵罐中的菌體生長與產(chǎn)酶過程和搖瓶相比存

9、在較大差距，油脂補料發(fā)酵并不能達到搖瓶的產(chǎn)酶效果。 (7)通過對搖瓶過程和發(fā)酵罐過程中菌絲微觀和宏觀形態(tài)的觀測和分析，發(fā)現(xiàn)菌絲微觀和宏觀形態(tài)變化對膜結(jié)合脂肪酶的合成影響非常顯著。搖瓶過程中，聚集狀態(tài)(塊狀，球狀，固定化)下的菌絲直徑稍寬，菌絲生長單位多，菌絲未出現(xiàn)分化現(xiàn)象；而松散狀態(tài)下的菌絲直徑稍窄，菌絲體到生長后期出現(xiàn)分化現(xiàn)象，并有膈出現(xiàn)。聚集狀態(tài)細胞的酶活力是松散狀態(tài)細胞酶活的3倍，說明菌絲聚集有利于膜結(jié)合脂肪酶的合成。通過

10、對發(fā)酵罐中菌體形態(tài)變化以及發(fā)酵液流變特性的研究，發(fā)現(xiàn)小球狀菌絲細胞有利于產(chǎn)酶，而松散狀菌絲細胞不利于產(chǎn)酶。對發(fā)酵液流變特性的測定結(jié)果表明，球狀菌體下的發(fā)酵液流動性要明顯好于松散狀菌體，有利于油脂的分散。載體固定化同時滿足了菌體形態(tài)呈聚集狀和細胞必須和油脂充分接觸兩個酶高產(chǎn)的必要條件，因此固定化細胞經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)后酶活能達到400U/g。 (8)為了驗證R.chinensisY92-M所產(chǎn)全細胞脂肪酶在非水相中的催化能力，將該酶和兩

11、種具有高酯合成活性的商品化脂肪酶Novo435和AmanoPS-C的酯合成能力進行比較，結(jié)果顯示Y92-M所產(chǎn)全細胞脂肪酶具有很好的酯合成能力。 (9)考察了該酶在正庚烷體系中催化脂肪酸乙酯的能力，當直鏈脂肪酸濃度為0.6mol/L時，該酶對碳鏈大于6的脂肪酸有較好的選擇性，轉(zhuǎn)化率可達90％以上。實驗結(jié)果還表明，該脂肪酶與出發(fā)菌所產(chǎn)脂肪酶相比，在無溶劑體系中能有效催化辛酸乙酯和油酸乙酯的合成。還考察了該酶在無溶劑體系中合成生物柴