耐冷假單胞菌pseudomonassp.g6產(chǎn)脂肪酶條件優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)研究

1、中文捅要中文摘要脂肪酶是一類能將長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯催化水解為甘油和脂肪酸的甘油酯鍵水解酶。廣泛用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)。目前研究和應(yīng)用的脂肪酶多為中溫脂肪酶，酶的最適溫度一般在4 0 “ 1 2 以上，在0 “ C 左右沒(méi)有酶活性。相比之下，低溫脂肪酶在低溫下仍然具有較高酶活性，其最適溫度在3 0 “ C 左右，在O ℃左右有一定的催化活性。因此在食品脫脂、環(huán)境修復(fù)和洗滌添加劑等方面應(yīng)用具有優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)引起了廣泛關(guān)注。本文首先

2、從實(shí)驗(yàn)室保存的耐冷菌中篩選脂肪酶的產(chǎn)生菌株，利用羅丹明B 平板法篩選出產(chǎn)脂肪酶較好的4 株茵命名為G 6 ，H 8 ，Z 4 和W 7 。對(duì)產(chǎn)脂肪酶活力最高的G 6 進(jìn)行菌種鑒定。對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，結(jié)合部分1 6 S r D N A序列分析，確定其為假單胞茵屬，命名為耐冷假單胞茵P s e u d o m o n a s s p ．G 6 。為了提高菌株產(chǎn)酶能力，在搖瓶發(fā)酵水平上，對(duì)耐冷假單胞菌P s e u d o m o

3、 n a s?。瓽 6 產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究。利用單因素實(shí)驗(yàn)研究不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響，確定產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成為葡萄糖5 ．0g ．U 1 ，O ' a - L h s 0 41 ．0 g ．L - 1 ，蛋白胨1 0g - L “ 1 ，K 2 H P 0 4 1 ．0g - L - 1 ，吐溫8 01 0 m L ·L - 1 ，M g S 0 4 2 ．0g - L - 1 ，N a C l2 ．0g -

4、 L - 1 。確定最佳的產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度2 0 ℃；培養(yǎng)基的初始p H 值7 ．5 ；接種量2 ％；裝液量2 0 * ／0 ；搖床轉(zhuǎn)速1 0 0r p m 。在最佳的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)2 4 h 時(shí)產(chǎn)酶達(dá)到最大值為6 5 ．6 6 U - m L 一。在單因素實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶條件。得到耐冷假單胞菌P s e u d o m o n a s s p ．G 6 最佳產(chǎn)酶條件為葡萄糖5 ．0g - L - 1 ，蛋

5、白胨1 2g - L “ 1 , K 2 H P 0 4 1 ．0g ' L ～，M g S 0 4 2 ．0g - L 1 ，( N F h h S 0 4 1 ．0g - L 一, N a C l l ．2g - L - 1 ，吐溫8 01 0m L ·L 一，轉(zhuǎn)速1 1 0 r p m ，裝液量2 0 ％，接菌量2 ％，培養(yǎng)基p H 7 ．5 ，培養(yǎng)溫度2 0 ℃。最佳條件下產(chǎn)酶水平達(dá)到1 0 7 ．0 3U &

6、#183;m L ～。對(duì)耐冷假單胞菌P s e u d o m o n a ss p ．G 6 所產(chǎn)的脂肪酶進(jìn)行分離純化研究。菌體發(fā)酵上清液經(jīng)丙酮沉淀、透析濃縮、高速逆流色譜技術(shù)等步驟的處理，得到純化的脂肪酶，S D S - P A G E 檢測(cè)其純度為電泳純，得到酶蛋白的分子量大約為6 5 K D a 。A b s t r a c tA b s t r a c tL i p a s ec o u l dh y d r o l y z

7、et r i g l y c e r c i d et og l y c e r o la n df a t t ya c i dw h i c hi sw i d e l ya p p l i e d t oi n d u s t r i a lp r o d u c t i o ns u c h a sf o o d ，f a t s , m e d i c i n ea n d c h e m i c a l ．T h ep r

8、e s e n tr e s e a r c ho nl i p a s e i s m a i n l yf o c u s e do nm e d i u m - t e m p e r a t u r e l i p a s e ，w h o s eo p t i m a lt e m p e r a t u r eo fh y d r o l y z a t i o n i s a r o u n d4 0 。C ，a n d

9、h a sn oc a t a l y t i c a c t i v i t y a t l o wt e m p e r a t u r e ．T h ec o l d —a d a p t e dl i p a s eh a s t h ef e a t u r eo f h a v e a h i g h c a t a l y t i ca c t i v i t y a tl o w t e m p e r a t u r

10、e ，a n d s t i l lh a v ec a t a l y t i ca c t i v i t ya tO * C ．T h i sm a k e s c o l d - a d a p t e d l i p a s et a k e a d v a n t a g e s o f a p p l y i n g t o f a t p r o c e s s e s ，e n v i r o n m e n t a

11、l r e s t o r a t i o n a n dd e t e r g e n t s ，i ta l s oa r o u s e s w i d e l ya t t e n t i o n s i nr e c e n ty e a r sI n t h i s p a p e r , 4 s t r a i n s o f p s y c h r o t r o p h i c b a c t e r i a w e

12、r e i d e n t i f i e d a sl i p a s e ．p r o d u c i n g b a c t e r i a w i t h h i g h c a p a b i l i t y o fp r o d u c i n g c o l d —a d a p t e d l i p a s e ，s e p a r a t e d l yn a m e dG 6 ，H 8 ，Z 4a n dW 7 b

13、 yu s i n g t h em e t h o d o f R h o d a m i n eB ．T h es t r a i nG 6 w a s p r o v e d t ob ew i t h t h eh i g h e s tl i p a s ea c t i v i t y , a n df u r t h e ri d e n t i f i e da s as t r a i no f P s e u d o

14、 m o n a ss p ．b a s e do nm o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dp h y l o g e n e t i ca n a l y s i so f 1 6 S r D N A ．T h e s t r a i nG 6 w a s n a m e d a s P s e u d

15、 o m o n a s s p ．G 6 ．I no r d e r t oi m p r o v et h el i p a s ey i e l dp r o d u c e db y t h e s t r a i no f P s e u d o m o n a ss p ．G 6 t h e f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s w e r e o p t i m i z e

16、 d b Y s i n g l e f a c t o r s e x p e r i m e n t s ，i n c l u d i n g c a r b o n S O u r e ，n i t r o g e ns o u r c e ，i n o r g a n i c s a l t ，c u l t u r a l t e m p e r a t u r ea n d S Oo n ．n l eo p t i m a

17、lf e r m e n t a t i o nn u t r i t i o n sw a s d e t e r m i n e da sg l u c o s e5 ．0 9 ’U l , ( N I - h h S 0 41 ．O g ·L - 1 , p e p t o n e l o g ·L ～’t K 2 H P 0 4 1 ．0 9 ·L ' 1 , T w e e n - 8 0

18、 1 0 m L ·L q , M g S 0 4 2 ．O g ’L 。1 , N a C L2 ．0 9 ·L ．1 ．B ys e e d i n g2 ％b a c t e r i al i q u i d i n t ot h em e d i u m w i t ha v o l u m eo f 2 0 ％o fi n c u b a t o r ，t h ei n i t i a lp H 7 ．5

19、，t h e ni n c u b a t e d a t2 0 。Cw i t h r o t a t i o n s p e e do f l O O r p m , t h ey i e M o f t h e l i p a s er e a c h e d t o6 5 ．6 6 U ‘瑚I L ～．B a s e o nt h e r e s u l t so f t h e s i n g l ef a c t o r e

20、 x p e r i m e n t ，r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yW a s a p p l i e df o rf u r t h e ro p t i m i z a t i o n ．F i n a l l y , t h eo p t i m i z e dc u l t u r i n gc o n d i t i o n sw e r eg l u c