利用原生質體融合技術構建高效產聚γ-谷氨酸菌株.pdf

1、聚γ-谷氨酸(γ-PGA)主要是由一些芽孢桿菌產生的一種水溶性的胞外氨基酸聚合物。近年來被作為高吸水性材料、增稠劑、藥物載體、生物絮凝劑及重金屬吸附劑等廣泛地應用于農業(yè)、食品、醫(yī)藥、化妝品及水處理等領域中，是一種具有極大開發(fā)價值和廣闊應用前景的新型多功能高分子材料。本文以枯草芽孢桿菌B53和克氏固氮桿菌N1為出發(fā)菌株，利用原生質體融合技術對γ-PGA高產株進行了選育研究。主要研究結果如下： (1)通過對親株抗藥性檢測，確定用四環(huán)

2、素和鏈霉素作為克氏固氮桿菌N1和枯草芽孢桿菌B53的抗性標記，即克氏固氮桿菌N1(Tcr，Steps)，枯草芽孢桿菌B53(Tcs，Stepr)。 (2)通過對親株原生質體制備時預處理條件的研究，確定了克氏固氮桿菌N1的預處理：在培養(yǎng)開始加入1.2U/mL的青霉素，繼續(xù)培養(yǎng)8h，0.01mol/LEDTA溶液37℃靜置處理1h；枯草芽孢桿菌B53在培養(yǎng)6h后加入1.2U/mL的青霉素作用4h。 (3)通過對兩親株原生質體

3、制備和再生條件的研究，確定了兩親株的原生質體制備和再生條件：克氏固氮桿菌N1溶菌酶作用濃度為0.2mg/mL，作用時間為8h，作用溫度為37℃；枯草芽孢桿菌B53的溶菌酶作用濃度為2mg/mL，作用時間為4h，作用溫度為37℃。 (4)通過聚乙二醇(PEG)誘導融合法，實現(xiàn)了枯草芽孢桿菌B53和克氏固氮桿菌N1之間的融合。通過對遺傳穩(wěn)定融合株產γ-PGA能力的比較，選育出γ-PGA產量有較大提高的菌株R8、R11、R36、R44