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文檔簡介
1、中醫(yī)中藥是我國的傳統(tǒng)醫(yī)學,長期實踐和研究表明,其在臨床治療上有著獨特的療效。自馬兜鈴酸事件發(fā)生以來,中藥安全性問題引起了國際上的廣泛關注,嚴重制約了中藥國際化發(fā)展進程。中藥毒副作用是伴隨著中藥療效同時出現(xiàn)的,最早從《神農(nóng)本草經(jīng)》開始就將中藥分為上、中、下三品,其中下品治病,有毒者多,不可長期服用。常用的有毒中藥大致可分為5類,即生物堿類、毒苷類、毒性蛋白類、動物類和礦物類,其中毒苷類又可分為強心苷類、皂苷類和氰苷類。為了保證中藥使用的安
2、全性,對中藥中有毒物質需要制定限量標準。
論文以氰苷類有毒中藥為出發(fā)點進行研究,氰苷是由氰醇衍生物的羥基和糖縮合形成的糖苷,不僅是該類有毒中藥中的有毒成分,也是其有效成分??嘈尤受諡榍柢疹惢衔锏拇?,也是常用中藥材苦杏仁、桃仁、郁李仁的有效成分,苦杏仁苷主要通過體內(nèi)酶解生成氫氰酸而產(chǎn)生藥理活性,小劑量氫氰酸可以鎮(zhèn)咳平喘,但大劑量會導致中毒。中國藥典2015版一部中規(guī)定,苦杏仁中苦杏仁苷含量不得少于3.0%,藥典中收載的含有苦
3、杏仁的中成藥有66種,其中葶貝膠囊中具體規(guī)定了每粒膠囊(0.35g)中的苦杏仁苷含量不得少于0.55mg,但對于同時作為內(nèi)源性毒性成分的苦杏仁苷而言,其安全限量尚屬空白。
論文致力于氰苷類中成藥中苦杏仁苷的限量標準研究。中成藥中的苦杏仁苷一般以一對差向異構體的形式存在,命名為D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷,在一定的條件下可以相互轉化。D-苦杏仁苷為天然存在形式具有明確的藥理活性,而L-苦杏仁苷的活性機制未見報道。所以探討了D-和L
4、-苦杏仁體外轉化過程和酶解產(chǎn)毒差異,針對中成藥中的苦杏仁苷的存在形式、含量、轉化規(guī)律以及毒性代謝產(chǎn)物氫氰酸檢測等問題開展了深入研究,為此類中成藥中苦杏仁苷安全限量的制定提供科學依據(jù)。全文共分為四章。
第一章為前言,首先對中藥的發(fā)展現(xiàn)狀和國際化進程做了簡要的介紹,隨著中藥不良反應事件的頻發(fā),安全性問題已成為中藥發(fā)展亟待解決的關鍵性問題,因此對目前已有的有毒物質評價機制進行了概述。其次主要介紹了氰苷類有毒中藥的種類、分布、結構、體
5、內(nèi)代謝過程以及產(chǎn)毒機制等背景研究,由于氰苷類本身既是有效成分也是有毒成分,所以對于中成藥中氰苷的含量測定顯得尤為重要。故以苦杏仁苷為代表,分別對其原型和代謝產(chǎn)物HCN的檢測方法進行歸納總結,為進一步的研究提供參考依據(jù)。最后提出本論文的立題依據(jù)和主要的研究內(nèi)容。
第二章,基于苦杏仁苷異構體的體外酶解過程,初步評估D-和L-苦杏仁苷的活性差異。首先系統(tǒng)研究了苦杏仁苷天然存在的D型結構向L型轉化的影響因素,運用半制備液相色譜技術獲得
6、 L-苦杏仁苷對照品,并對其結構進行了鑒定和確證,在得到L-苦杏仁苷對照品的基礎上,研究了D-和L-苦杏仁苷體外酶解規(guī)律。結果表明堿性條件是苦杏仁苷異構化的重要因素之一,D-苦杏仁苷在pH11的NaOH溶液中靜置30分鐘為轉化生成L-苦杏仁苷的最佳條件。在此基礎上,對苦杏仁苷差向異構體混合物進行了分離提純,制備得到純度為99.7%的L-苦杏仁苷對照品,其結構經(jīng)過質譜和核磁共振譜的確證。體外酶解實驗發(fā)現(xiàn),D-和L-苦杏仁苷酶解產(chǎn)毒過程中存
7、在明顯差異。在相同條件下,D型苦杏仁苷的酶解速率常數(shù)是L型的7.7倍。由于苦杏仁苷在體內(nèi)同樣是經(jīng)酶解生成氫氰酸發(fā)揮藥效,所以酶解速率的不同將導致氫氰酸暴露劑量的差異,可能導致D-和L-苦杏仁苷在藥效與毒性等方面存在差異,D-苦杏仁苷酶解速率更快,可能在發(fā)揮藥效上起著更大的作用。
第三章,基于建立的高效液相色譜方法(HPLC)對氰苷類中成藥中苦杏仁苷的含量進行測定,重點關注不同來源和劑型的中成藥中D-和L-苦杏仁苷的含量及其轉化
8、。首先,建立了靈敏準確的測量中成藥中D-和L-苦杏仁苷含量的HPLC方法,并開展了相關的方法學研究。結果表明,D-和L-苦杏仁苷在2~500mg/L范圍內(nèi)線性關系良好,R2為0.999,檢測限為0.8mg/L,定量限為2mg/L,精密度、回收率、穩(wěn)定性和重復性均符合要求,說明該方法穩(wěn)定可靠。然后,以含有苦杏仁的中成藥為代表,通過該方法對17種42個批次的中成藥中的D-和L-苦杏仁苷含量以及異構化比例進行了測定,實驗結果顯示D-苦杏仁苷含
9、量范圍是0.018%~1.158%,L-苦杏仁苷含量范圍是0.003%~0.434%,異構化比例范圍是8.03%~53.35%?;诋悩嫽壤牟町惪赡軐е虏煌乃幚砘钚约岸拘缘葐栴},本課題針對通宣理肺方劑開展相關研究,通過比較不同劑型的通宣理肺方劑以及不同來源的通宣理肺丸中D-和L-苦杏仁苷的含量和異構化比例,發(fā)現(xiàn)中成藥的劑型、工藝和來源等因素均可能對苦杏仁苷的差向異構化比例產(chǎn)生影響。研究表明劑型因素是D-苦杏仁苷向L-苦杏仁苷轉化的
10、重要因素,劑型工藝越復雜,生成的L-苦杏仁苷的含量越高。該結果可為相關中成藥產(chǎn)品的工藝優(yōu)化提供借鑒,且所得含量及異構化比例等研究結果可為氰苷類中成藥中苦杏仁苷的安全限量標準制定提供依據(jù)。最后,基于多級質譜技術,針對不同種類氰苷,開展了質譜裂解規(guī)律的研究,研究表明氰苷化合物中糖基與氰醇間C—O鍵容易斷裂,形成多糖或單糖的特征峰。總結已有氰苷的質譜裂解規(guī)律,對于氰苷篩選以及未知氰苷的結構鑒別具有借鑒意義,為實現(xiàn)氰苷物質快速篩選策略提供試驗依
11、據(jù)。
第四章,立足復雜基質,建立了表面增強拉曼光譜(SERS)和氣相色譜(GC)兩種方法,快速檢測中成藥提取液中氫氰酸的含量。鑒于氰苷化合物在中成藥加工或口服過程中有可能發(fā)生自身酶解而產(chǎn)生氫氰酸,本課題致力發(fā)展針對中成藥中氰化物的簡單靈敏的檢測方法。SERS技術具有快速、靈敏、便攜等特點,在現(xiàn)場檢測中具有極大的優(yōu)勢,但是在復雜基質中,會受到其他物質的嚴重干擾。因此本課題通過設計在線凈化富集裝置,解決了復雜基質中測量CN-的難題
12、。通過在線凈化富集裝置檢測不同濃度氰化物對照品,檢測限為0.05mg/L,在濃度范圍0.1~2mg/L內(nèi)線性良好,R2為0.997,由于拉曼散射強度容易受光學系統(tǒng)參數(shù)等因素的影響,且線性范圍較窄,為了驗證該SERS方法的有效性和可靠性,所以本課題進一步發(fā)展了定量更為準確的GC方法檢測中成藥中氰化物含量,并對其進行了方法學考察,結果表明該方法在范圍0.05~50mg/L內(nèi)的線性良好, R2為0.996,定量限為0.05mg/L,檢測限為0
13、.025mg/L。運用這兩種方法,對不同的氰苷類中成藥進行測量,結果表明僅在個別中成藥中檢出氰化物,表面增強拉曼光譜和氣相色譜的檢測結果基本一致。通過氣相色譜方法的分析結果所得,中成藥中HCN含量最高26.60mg/L,未達到人體中毒劑量,但由于中成藥一般為長期服用,所以長期低劑量毒性效應不可忽視。另外,發(fā)現(xiàn)測得氰化物的中成藥均為丸劑,可能由于丸劑加工工藝簡單,制備過程中酶沒有完全失活,所以中成藥中苦杏仁苷的限量,需要對D-和L-苦杏仁
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