紫花地丁黃酮苷類(lèi)成分的定性定量研究.pdf_第1頁(yè)
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1、中藥紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁Violayedoensis Makino的干燥帶根全草,為多年生草本,分布于我國(guó)大部分地區(qū),朝鮮、俄羅斯、日本等也有分布。紫花地丁味苦、辛,性寒,歸心、肝經(jīng);具有清熱解毒,涼血消腫等功效;可用于治療疔瘡腫毒、癰疽發(fā)背、丹毒、蛇毒咬傷等?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抑菌、抗炎、抗內(nèi)毒素、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抑制HIV病毒等作用。臨床上主要用于治療各種炎癥,包括扁桃體炎、蜂窩組織炎、流行性腮腺炎、皮膚急性化膿性炎

2、癥等。其化學(xué)成分復(fù)雜,含有黃酮及其苷類(lèi)、香豆素類(lèi)、糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等多種有效成分,并富含多種微量元素。其中黃酮類(lèi)及香豆素類(lèi)化合物是紫花地丁最為主要的活性成分。
  本研究首次從抗病毒(流感病毒及皰疹病毒)、抗菌(大腸桿菌及金黃色葡萄球菌等)、抗氧化(清除DPPH自由基)等方面系統(tǒng)地對(duì)紫花地丁的“解毒”作用部位進(jìn)行篩選。發(fā)現(xiàn)紫花地丁各個(gè)不同極性的提取物均不具有體外抗流感病毒和皰疹病毒的作用;在抗菌方面,雖有文獻(xiàn)報(bào)道其具有較強(qiáng)的抗菌活性

3、(包括鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬巴氏桿菌、沙門(mén)氏菌、表皮葡萄球菌等),但本研究發(fā)現(xiàn)其只對(duì)大腸桿菌顯示出一定的抑制活性,而對(duì)其他菌沒(méi)有明顯的抑制活性;在抗氧化活性上,其醇提物的乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位具有較好的活性。以上結(jié)果表明紫花地丁的“解毒”作用主要表現(xiàn)在抗菌和抗氧化作用上,其解毒活性部位為醇提物的乙酸乙酯部位和正丁醇部位。
  鑒于課題組前期已對(duì)紫花地丁醇提物的石油醚部位和乙酸乙酯部位進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)的化學(xué)成分研究

4、,本研究主要對(duì)其具抗氧化活性和抗菌活性的正丁醇部位進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究,運(yùn)用多種色譜分離方法,共分離鑒定了11個(gè)化合物,其中包括6個(gè)黃酮碳苷類(lèi)化合物,分別為芹菜素-6,8-二-C-β-D-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(2)、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-L-阿拉伯糖苷(3)、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷(4)、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C

5、-β-D-木糖苷(5)和芹菜素-6,8-二-C-α-L-阿拉伯糖苷(6);3個(gè)黃酮氧苷類(lèi)化合物,分別為山奈酚-3-O-β-D-槐糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(7)、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷(8)和山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(9);另外還分離得到了腺苷(10)以及秦皮乙素(11)。其中化合物8為首次從該植物中分離得到,化合物4和7為首次從堇菜屬ViolaL.植物中分離得到。
  本研究對(duì)分

6、離得到的11個(gè)單體化合物進(jìn)行了清除DPPH自由基的活性測(cè)定,發(fā)現(xiàn)香豆素類(lèi)化合物秦皮乙素的抗氧化作用最強(qiáng),黃酮碳苷和氧苷的活性較弱;3個(gè)黃酮氧苷類(lèi)化合物的抗氧化活性比較接近,且均強(qiáng)于黃酮碳苷類(lèi)成分。對(duì)紫花地丁中含量較高的兩個(gè)黃酮碳苷類(lèi)化合物首次進(jìn)行了抗菌活性測(cè)定,發(fā)現(xiàn)均不具有抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)及綠膿桿菌的作用。以上結(jié)果表明黃酮碳苷類(lèi)化合物不具有抗菌活性,但具有一定的抗氧化活性。<

7、br>  紫花地丁中所含黃酮碳苷類(lèi)化合物極性較大、結(jié)構(gòu)相近、分離難度大、結(jié)構(gòu)鑒定需要量大且一般需在高溫下進(jìn)行測(cè)定,采用傳統(tǒng)的分離方法僅能對(duì)紫花地丁中含量較高的黃酮碳苷類(lèi)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,因此本研究首次采用高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)-電噴霧離子化-離子阱質(zhì)譜(HPLC-PDA-ESI-IT-MSn)聯(lián)用技術(shù)對(duì)紫花地丁中黃酮碳苷類(lèi)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,探討紫花地丁黃酮碳苷特別是雙糖碳苷類(lèi)化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律,在對(duì)5個(gè)黃酮碳苷類(lèi)對(duì)照品質(zhì)

8、譜裂解規(guī)律的研究中發(fā)現(xiàn):1)對(duì)這些化合物進(jìn)行了MS1-10級(jí)質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)其MS1-5級(jí)質(zhì)譜表現(xiàn)出該類(lèi)化合物良好的結(jié)構(gòu)特征;2)與文獻(xiàn)報(bào)道一致,在MS2和MS3級(jí)質(zhì)譜中發(fā)現(xiàn)黃酮碳苷類(lèi)化合物的診斷離子0,2X-;3)MS3中的基峰0,2X0,2X-碎片離子可以作為苷元的診斷離子,MS2和MS3中的[M-60-H]-、[M-90-H]-碎片離子可以作為含五碳糖的診斷離子,[M-120-H]-碎片離子可以作為六碳糖的診斷離子;4)當(dāng)黃酮雙糖碳

9、苷C-8位糖基為非優(yōu)勢(shì)構(gòu)象時(shí),會(huì)優(yōu)先發(fā)生C-8位糖基的開(kāi)環(huán)反應(yīng),此規(guī)律與文獻(xiàn)報(bào)道的黃酮碳苷類(lèi)化合物一般C-6位糖基優(yōu)先斷裂的發(fā)現(xiàn)不一致。我們將該MS1-5裂解規(guī)律用于紫花地丁中該類(lèi)化合物的檢測(cè)與結(jié)構(gòu)表征,并結(jié)合該類(lèi)化合物PDA特征圖譜以及保留時(shí)間,從紫花地丁醇提物正丁醇部位共檢測(cè)出黃酮苷類(lèi)化合物35個(gè),包括3個(gè)黃酮氧苷類(lèi)和32個(gè)黃酮碳苷類(lèi)化合物(其中包括1個(gè)黃酮單糖碳苷、26個(gè)黃酮雙糖碳苷和5個(gè)乙酰基黃酮雙糖碳苷類(lèi)化合物)。我們首次從紫

10、花地丁中檢測(cè)出了乙酰基黃酮碳苷。因此,我們首次建立的LC-MSn法可以對(duì)紫花地丁中的黃酮苷,特別是黃酮碳苷類(lèi)化合物進(jìn)行有效的檢測(cè)和結(jié)構(gòu)表征。
  紫花地丁中的黃酮苷類(lèi)特別是碳苷類(lèi)成分極性大,含量低、傳統(tǒng)色譜方法較難以分離,因此,結(jié)合黃酮碳苷類(lèi)化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律,我們首次采用了HPLC-ESI-IT-MS/MS法結(jié)合微波輔助萃取和固相萃取法,對(duì)紫花地丁中的3個(gè)主要黃酮碳苷類(lèi)成分芹菜素-6,8-二-C-β-D-葡萄糖苷(S1)、芹菜

11、素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(S2)和芹菜素-6,8-二-C-α-L-阿拉伯糖苷(S3)進(jìn)行了定量分析。采用SRM模式,色譜柱為Waters C18色譜柱(2.1×100 mm,1.7μm),流動(dòng)相為乙腈-水,梯度洗脫(0 min,A=5%;0~30 min,A=5%~12%;30~40min,A=12%~13%;40~45min,A=13%~100%),流速為180μL/min。以上3種成分線性范圍分別為0.

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