Sp1、IRF1和IRF2調(diào)控載脂蛋白L1的表達(dá).pdf

1、目的：本課題主要是深入研究Sp1、IRF1和IRF2調(diào)控載脂蛋白L1基因表達(dá)的機(jī)制。
　　方法：提取細(xì)胞RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用PCR的方法，擴(kuò)增IRF2全長(zhǎng)基因片段，將其克隆到pflag-cmv-2表達(dá)載體上,命名為pFLAG-IRF2。其它反式作用因子由博尚生物技術(shù)有限公司合成，并分別命名為pFLAG-Sp1,pFLAG-Sp3,pFLAG-KLF4,pFLAG-KLF6,pFLAG-IRF1,pFLAG-IRF3,pF

2、LAG-IRF9。將各反式作用因子與啟動(dòng)子通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入細(xì)胞，48小時(shí)后利用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試驗(yàn)檢測(cè)熒光值,通過(guò)此方法初步篩選出可能的反式作用因子Sp1、IRF1及IRF2。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行電泳遷移率實(shí)驗(yàn),若核蛋白能與探針結(jié)合，其在非變性凝膠上的電泳速度會(huì)減慢，從而形成阻滯帶，若再與抗體結(jié)合，其速度會(huì)進(jìn)一步減慢，形成超阻滯帶。通過(guò)電泳遷移率競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)及超阻滯試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了Sp1和IRF2能與該啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合。由于細(xì)胞中IRF

3、1表達(dá)量低,在首次超阻滯實(shí)驗(yàn)中，IRF1并未出現(xiàn)超阻滯條帶。提取經(jīng)過(guò)INF-γ干預(yù)48小時(shí)后的細(xì)胞核蛋白，并經(jīng)Western Blot確定IRF-1表達(dá)量增加后，再進(jìn)行超阻滯試驗(yàn)，出現(xiàn)了超阻滯條帶，證實(shí)了IRF-1也可以與該啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合。
　　結(jié)果：1.成功構(gòu)建pFLAG-IRF2表達(dá)克隆；2.過(guò)表達(dá)pFLAG-Sp1及pFLAG-IRF1、pFLAG-IRF2增加ApoL1的啟動(dòng)子活性；3.INF-γ能促進(jìn)IRF1的表達(dá)增