靶向抑制Sp1對肝癌細(xì)胞Sp1下游基因和細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：
　　 研究Mithramycin A(光輝霉素)對人肝癌細(xì)胞Huh-7的促凋亡作用。通過構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體，運(yùn)用RNAi技術(shù)，為探索阻斷核轉(zhuǎn)錄因子Sp1信號通路的新途徑及其下游信號通路研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 采用CCK-8活細(xì)胞計數(shù)試劑盒觀察Mithramycin A對Huh-7細(xì)胞的生長抑制作用。通過倒置顯微鏡觀察Mithramycin A作用后細(xì)胞形態(tài)變化，Hoechst33342/PI雙熒

2、光染色分析細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞凋亡率。運(yùn)用Realtime-PCR法和Western-blot法檢測Mithramycin A不向濃度及不同時間作用后Huh-7細(xì)胞中Sp1、VEGF、c-Met、EGFR表達(dá)情況。將Sp1 shRNA(短發(fā)夾狀RNA，short hairpin RNA)序列克隆到質(zhì)粒pGCsi3.0載體，采用HilyMax脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將構(gòu)建的Sp1 shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Huh-7細(xì)胞。采用實時定量

3、PCR技術(shù)和Western-blot技術(shù)分別檢測Huh-7細(xì)胞中Sp1、VEGF、c-Met和EGFRmRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：
　　 Mithramycin A可抑制Huh-7細(xì)胞的生長，其機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。這種抑制作用呈濃度及時間依賴性，半數(shù)抑制濃度(IC50)為60.12nmol/L。濃度為5×10-2μmol/L的Mithramycin A作用細(xì)胞72h后可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀檢測

4、腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)典型亞二倍體凋亡小峰。Mithramycin A對Sp1、VEGF、c-Met、EGFR在蛋白水平的表達(dá)有抑制作用。Sp1 shRNA表達(dá)質(zhì)粒能有效地抑制Huh-7細(xì)胞Sp1、VEGF、c-Met和EGFR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：
　　 Mithramycin A對Huh-7細(xì)胞有明顯的生長抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。Mithramycin A能抑制人肝癌Huh-7細(xì)胞Sp1及其下游基因表達(dá)。siR