草魚(Ctenopharyngodon idellus)Sp1的克隆及其表達(dá)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子Sp1(Specificity protein 1)可調(diào)控多種基因的激活，參與多數(shù)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化和細(xì)胞周期代謝，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究利用T-A和RACE技術(shù)從草魚（Ctenopharyngodon idellus）腸道克隆出Sp1cDNA全序列，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了草魚不同組織、不同發(fā)育時(shí)期Sp1基因的表達(dá)，并探討了在日糧中添加不同蛋白源、不同蛋白水平和谷氨酰胺二肽等營(yíng)養(yǎng)素對(duì)草魚Sp1基因表達(dá)的調(diào)控。

2、　　1、草魚Sp1cDNA克隆及生物信息學(xué)分析
　　草魚Sp1cDNA全長(zhǎng)為1914bp，包括1482bp的編碼區(qū)、5bp的5'UTR和426bp的3'UTR，共編碼493個(gè)氨基酸。等電點(diǎn)為8.27，主要的元素成分含量為C:2.23％，N:4.87％，H:2.43％，S:9.94％，T:11.16％。分子式為C2237H3600N662O738S20。氨基酸組成中，Thr(11.2％)和Gln(10.1％)含量相對(duì)較高。氨基酸序列

3、的疏水性:MAX，2.93;MIN，-1.89。磷酸化位點(diǎn):Ser21個(gè)，Thr7個(gè)，Tyr2個(gè)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明Sp1在進(jìn)化上比較保守，與鯉科魚中的斑馬魚(Daniorerio)親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)66％。
　　2、草魚Sp1基因的時(shí)空表達(dá)
　　采用RT-qPCR檢測(cè)Sp1基因在草魚心臟、肝胰臟、脾臟、腎臟、肌肉、垂體、鰓、腦、前腸、中腸和后腸等組織的表達(dá)差異。結(jié)果表明:Sp1 mRNA在草魚中腸和鰓中表達(dá)最高，后腸和腦

4、次之，其余較低;胚胎發(fā)育過程中，共檢測(cè)10個(gè)時(shí)期Sp1mRNA相對(duì)表達(dá)量，出膜前的表達(dá)量明顯高于出膜后。出膜前各時(shí)期的表達(dá)量波動(dòng)較大，原腸期和器官期表達(dá)顯著，囊胚期次之，出膜前期表達(dá)量降至最低，并在出膜后一直維持較低水平，只在出膜期第3天有短暫上調(diào)。
　　3、外源蛋白對(duì)草魚Sp1基因表達(dá)的影響
　　本實(shí)驗(yàn)以體重為11.55±0.45g的健康草魚為研究對(duì)象，探討日糧中不同蛋白源和不同蛋白水平對(duì)草魚Sp1基因表達(dá)的影響。在不同蛋

5、白源實(shí)驗(yàn)中，分別采用魚粉、豆粕和魚粉+豆粕作為飼料蛋白;在不同蛋白水平實(shí)驗(yàn)中，分別在飼料中添加22％、27％、32％、37％和42％的粗蛋白。同時(shí)進(jìn)行養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，并在養(yǎng)殖的第7d、第14d、第21d和第28d，采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)中腸Sp1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　不同蛋白源實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)，Sp1 mRNA表達(dá)量在3組實(shí)驗(yàn)魚中均呈先升高后下降的趨勢(shì)，且均在飼喂21d時(shí)達(dá)到最高值。每個(gè)時(shí)期的表達(dá)量均為:混合組

6、＞魚粉組＞豆粕組。在第7d、第14d和第21d，混合組的表達(dá)量均顯著高于魚粉組和豆粕組，到28d時(shí)，魚粉組的表達(dá)量與混合組不再有顯著性差異。以上結(jié)果說(shuō)明混合蛋白源對(duì)草魚Sp1的表達(dá)具有更強(qiáng)的上調(diào)作用，且魚粉優(yōu)于豆粕。
　　隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)，日糧中添加不同蛋白水平對(duì)草魚腸道Sp1 mRNA表達(dá)量的影響表現(xiàn)出與不同蛋白源實(shí)驗(yàn)相同的規(guī)律，即Sp1 mRNA表達(dá)量在飼喂5種不同蛋白水平飼料的實(shí)驗(yàn)魚中均呈先升高后下降的趨勢(shì)，且均在飼喂21

7、d時(shí)達(dá)到最高值，說(shuō)明Sp1 mRNA的表達(dá)與草魚的生長(zhǎng)發(fā)育有一定關(guān)系。除第7d各組的Sp1mRNA表達(dá)量無(wú)差異外，每個(gè)時(shí)期均為27％粗蛋白添加組最高，且與其他組均有顯著性差異(p＜0.05)，而5個(gè)不同水平粗蛋白添加組相比，表現(xiàn)為:27％組＞22％組＞32％組＞37％組＞42％組，說(shuō)明日糧中添加27％左右的粗蛋白可以更好地促進(jìn)草魚腸道Sp1的表達(dá)，蛋白含量偏高或偏低都可能會(huì)起抑制作用。
　　4、谷氨酰胺二肽對(duì)草魚Sp1基因表達(dá)的影