淀粉液化芽孢桿菌ES-2抗菌脂肽生產(chǎn)工藝的研究.pdf

1、抗菌脂肽是芽孢桿菌屬產(chǎn)生的微生物來(lái)源的抗菌肽，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒和支原體的功能。由于抗菌脂肽高效、無(wú)毒，使得在生物醫(yī)藥方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。此外，脂肽作為一種生物表面活性劑在石油工業(yè)、食品、化妝品和農(nóng)業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
　　 近幾年來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室篩選到一株植物內(nèi)生菌菌株Bacillus amyloliquefaciens ES-2，該菌株產(chǎn)生的抗微生物活性物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性和部分酶穩(wěn)定性，抗菌譜廣，抗微生物活性高。

2、前期研究表明該微生物活性物質(zhì)主要為surfactin和fengycin，均為環(huán)狀脂肽。
　　 為了實(shí)現(xiàn)抗菌脂肽的工業(yè)化，急需解決發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的泡沫問(wèn)題以及確定簡(jiǎn)單可行的生產(chǎn)工藝。因此本研究從消泡劑出發(fā)，研究消泡劑消泡的可能性，同時(shí)研究提取純化抗菌脂肽的方法，最后對(duì)溶氧對(duì)發(fā)酵的影響進(jìn)行了初步的研究，得出以下研究結(jié)果：
　　 1.將大豆油、有機(jī)硅消泡劑和聚醚類消泡劑三種消泡劑分別用于Bacillusamyloliquefa

3、ciens ES-2抗菌脂肽發(fā)酵，研究表明三種消泡劑均可以實(shí)現(xiàn)消泡和抑泡，其中大豆油和有機(jī)硅消泡劑表現(xiàn)出更好的消泡性能和抑泡性能。以大豆油和聚醚類消泡劑為消泡劑的發(fā)酵液的菌體含量高于不添加消泡劑的發(fā)酵液.。其中以聚醚為消泡劑的發(fā)酵液的菌體干重增大的最多，發(fā)酵24h時(shí)其菌體干重為對(duì)照的2.14倍。以大豆油和聚醚類消泡劑為消泡劑的發(fā)酵液中抗菌脂肽的含量相對(duì)于不加消泡劑下的發(fā)酵有了很大的提高，其中大豆油帶來(lái)的產(chǎn)量的增加尤其明顯，脂肽達(dá)到了24

4、97.67mg/L。
　　 2.在抗菌脂肽的提取中，大豆油的加入有利于抗菌脂肽的酸沉提取，酸沉提取率達(dá)到了92.29％。以大豆油為消泡劑的發(fā)酵得到的抗菌脂肽更容易使用甲醇和乙醇提取出來(lái)，提取率達(dá)到了很高水平，并且其產(chǎn)品純度也略高于不加消泡劑發(fā)酵提取到的抗菌脂肽產(chǎn)品純度，因此可以確定大豆油為適合抗菌脂肽發(fā)酵的消泡劑。選擇硅藻土過(guò)濾的方法獲得酸沉后的絮凝物，并選擇乙醇對(duì)做有機(jī)溶劑提取，乙醇用量跟發(fā)酵液總量的體積比為1:2.5時(shí)抗菌脂

5、肽提取率達(dá)到了88.72％。
　　 3.對(duì)抗菌脂肽粗提物進(jìn)行了大孔樹(shù)脂吸附純化研究，結(jié)果表明X-5大孔樹(shù)脂在靜態(tài)吸附中表現(xiàn)出優(yōu)秀的對(duì)抗菌脂肽的吸附能力，吸附量達(dá)到了57.73 mg·g-1，吸附率達(dá)到了85.05％，在解吸結(jié)果中，解析率達(dá)到了65.59％，綜合吸附和解吸效果，選擇X-5大孔樹(shù)脂作為研究吸附純化的材料。經(jīng)過(guò)動(dòng)態(tài)吸附初步研究結(jié)果表明經(jīng)過(guò)吸附純化抗菌脂肽純度達(dá)到了72.86％，相對(duì)原粗提物的純度有了較大的提高，因此可以

6、選擇大孔樹(shù)脂吸附作為提高抗菌脂肽純度的方法。純化采用100％乙醇洗脫，純化的工藝參數(shù)為：上樣濃度14.4mg/mL、上樣速率1mL/min，洗脫速率2 mL/min、洗脫劑用量2.5BV，產(chǎn)品的回收率達(dá)90.01％，純度達(dá)74.4％。
　　 4.試驗(yàn)通過(guò)溶氧電極觀察記錄發(fā)酵過(guò)程中的溶氧變化，結(jié)果顯示發(fā)酵6h后溶氧開(kāi)始下降，并且下降幅度逐漸增大，到18h時(shí)溶氧為0.6％，溶氧達(dá)到了一個(gè)非常低的水平，并維持此低溶氧水平至發(fā)酵結(jié)束。為

7、研究溶氧對(duì)發(fā)酵的影響，采用三種溶氧控制方案對(duì)抗菌脂肽的發(fā)酵進(jìn)行控制，經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵全過(guò)程保持溶氧水平在5％以上時(shí)，菌體濃度、細(xì)胞比生長(zhǎng)速率和細(xì)胞生產(chǎn)強(qiáng)度均得到了提高，但是抗菌脂肽產(chǎn)量、產(chǎn)物比合成速率和產(chǎn)物生產(chǎn)強(qiáng)度均下降。在發(fā)酵后期即菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后提高溶氧水平在5％以上時(shí)，菌體生長(zhǎng)相對(duì)正常發(fā)酵沒(méi)有變化，而抗菌脂肽產(chǎn)量、產(chǎn)物比合成速率和產(chǎn)物生產(chǎn)強(qiáng)度均上升。因此可以說(shuō)明溶氧在抗菌脂肽發(fā)酵過(guò)程中是調(diào)整菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成代謝的重要因素。