淀粉液化芽孢桿菌β-葡聚糖酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、β-1，3-1，4-葡聚糖酶能夠有效地降解植物和微生物細(xì)胞壁來(lái)源的β-葡聚糖，通過(guò)添加外源β-葡聚糖酶可有效解決啤酒釀造中麥汁過(guò)濾困難，啤酒的非生物穩(wěn)定性降低等問(wèn)題，在飼料工業(yè)中也可提高禽畜對(duì)麥類飼料養(yǎng)分的吸收效率。如何獲得高產(chǎn)β-葡聚糖酶的菌株已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)之一。本文主要以一株高產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)為出發(fā)菌，構(gòu)建了一株高效表達(dá)β-1，3-1，4-

2、葡聚糖酶的大腸桿菌(Escherichiacoli)重組菌，并對(duì)重組酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。 通過(guò)PCR手段將本研究室保藏的一株高產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢桿菌的bgl基因(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)EU623974)擴(kuò)增，克隆至三種不同性質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒載體oEGX-4T-1、pET20b(+)和pET28a(+)中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)

3、-bgl。將pEGX-4T-1-bgl轉(zhuǎn)化三種不同的大腸桿菌宿主；pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，采用IPTG在30℃下誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，比較pEGX-4T-1的GST融合表達(dá)、pET20b(+)的PelB信號(hào)肽指導(dǎo)的分泌型表達(dá)和常用的帶有強(qiáng)啟動(dòng)子和lac操作子的pET28aa[+)的組氨酸標(biāo)簽和T7標(biāo)簽的融合表達(dá)的效果。經(jīng)SDS-PAGE分析和酶活測(cè)定表明，五種重組菌均表達(dá)

4、出了重組蛋白，其中重組菌E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl具有最高的表達(dá)酶活，總酶活可達(dá)322.0±8.8U/mL，明顯高于其他四種重組菌，為出發(fā)菌在最適搖瓶條件下所產(chǎn)酶活的40.1％，可以作為今后定向改造的適宜菌株。 為了考察E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl所產(chǎn)重組酶的實(shí)用價(jià)值，本文比較了制備粗酶液時(shí)各種破壁方法對(duì)重組酶活力的影響，結(jié)果表明凍融法效果較好。粗酶液經(jīng)乙醇分級(jí)沉淀和

5、DEAE-650M離子交換層析分離純化，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證，得到了較純的重組酶，純化倍數(shù)為19.85倍，回收率為20.60％，比活力為13,437U/mg，分子量為30kDa左右。 對(duì)純化后的重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究表明，重組酶最適pH值為6.0，在pH4.5-6.0范圍內(nèi)較為穩(wěn)定；最適溫度為50℃，40-50℃范圍內(nèi)較穩(wěn)定，10mmol/L的Cu2+和Fe2+對(duì)酶活有顯著的抑制作用，與野生酶性質(zhì)大致相同，表明該酶在啤酒釀造工業(yè)