海洋源解淀粉芽孢桿菌細菌素CAMT2發(fā)酵優(yōu)化、分離及抗菌機理研究.pdf

1、細菌素 CAMT2是分離自海洋寶石石斑魚腸道的解淀粉芽孢桿菌 ZJHD-06(Bacillus amyloliquefaciens ZJHD-06)產(chǎn)生的一種抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性強的肽類物質(zhì)。本課題通過對產(chǎn)細菌素CAMT2發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化獲得高抗菌活性發(fā)酵液,并對發(fā)酵上清液進行一系列的分離純化,獲得一定純度的細菌素CAMT2,最后對分離純化的細菌素CAMT2進行抗菌機理研究。研究結(jié)果如下:
　　(1)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)細菌

2、素 CAMT2發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化:以抑制彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)的效價為抗菌活性評價指標,以從7種培養(yǎng)基中篩選出的TGE培養(yǎng)基作為發(fā)酵優(yōu)化的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,對選擇的16個因素設(shè)計Plackett-Burman實驗,篩選出葡萄糖、FeSO4、Vc3個主效因素,再通過最陡爬坡實驗分別確定7.00 g/L、0.09 mg/L、0.65 g/L作為中心水平,并設(shè)計了Box-Behnken實驗。對實驗結(jié)果運用JMP軟件分析得出

3、最佳配比,即葡萄糖7.15 g/L、FeSO40.11 mg/L、Vc0.69 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、酵母膏10.0 g/L;通過驗證實驗證實,優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基所產(chǎn)發(fā)酵上清液的抗菌效價是原始TGE培養(yǎng)基的2.1倍。
　　(2)解淀粉芽孢桿菌細菌素CAMT2分離純化:細菌素CAMT2分離純化分為硫酸銨沉淀、SephadexG-50柱層析、SDS-PAGE電泳、蛋白膠條鑒定4個步驟。通過20％~80%飽和度的硫酸銨沉淀實

4、驗,確定了發(fā)酵上清液最佳沉淀飽和度為60%。沉淀的蛋白用磷酸緩沖液溶解、透析后過SephadexG-50柱,洗脫液為0.01 mol/L pH7.0磷酸緩沖液,對每管收集液在吸收波長275 nm下檢測吸收值,并繪制洗脫曲線。洗脫曲線表現(xiàn)出兩個洗脫峰,檢測第一個峰收集液(F1)和第二峰收集液(F2)的抗菌活性后發(fā)現(xiàn)F1無抗菌活性,F2抗菌活性明顯。F2收集液用超純水透析后真空冷凍干燥,干燥后粉末用磷酸緩沖液溶解并進行SDS-PAGE電泳,

5、結(jié)果顯示僅有分子量約20 kDa的一條蛋白條帶。將這一蛋白條帶經(jīng)處理后交于華大基因(BGI)進行全質(zhì)譜分析及蛋白鑒定,鑒定結(jié)果表明存在5種蛋白,經(jīng)過比對和分析得知分子量為19608.57 Da、N末端氨基酸序列為MKIARTAIGSCLALSLTIPF的2號蛋白和分子量為20265.57 Da、N末端氨基酸序列為MKKWLLFLTTITLILSLGTA的3號蛋白為分離的目的蛋白。
　　(3)解淀粉芽孢桿菌細菌素CAMT2抗菌機理研

6、究:實驗從對Bacillus flexus的生長抑制狀況、細胞形態(tài)變化、細胞膜通透性的影響三個方面探討細菌素CAMT2的抗菌機理。通過繪制Bacillus flexus的生長抑制曲線發(fā)現(xiàn)細菌素CAMT2對Bacillus flexus的生長抑制作用明顯,并且出現(xiàn)部分溶菌現(xiàn)象;運用掃描電鏡觀察到被作用前后細胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化,作用后的細胞兩端變尖,細胞邊緣成鋸齒狀,部分細胞破裂;在對細胞膜通透性的影響方面,實驗測定了電導率、胞內(nèi)外K+濃