復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品中目標(biāo)組分柱層析分離純化策略研究.pdf

1、本論文將復(fù)雜蛋白質(zhì)混合樣品中目標(biāo)蛋白的分離純化抽象為雙組分和三組分混合蛋白樣品的分離純化過(guò)程，以雙組分和三組分蛋白質(zhì)混合物中目標(biāo)蛋白的離子交換柱層析分離純化過(guò)程為研究對(duì)象，探討了目標(biāo)蛋白在層析柱上的分離純化策略，并以從豬全血中分離純化高純度豬血紅蛋白和從戊二醛聚合豬血紅蛋白中去除低分子量血紅蛋白的分離純化策略為例，驗(yàn)證了本文提出的分離純化策略，為中試和規(guī)?；蛛x純化目標(biāo)蛋白提供了高效和可行的解決方案。 在雙組分混合樣品的分離純化

2、策略研究中，以豬血紅蛋白和溶菌酶在CMSepharoseFast—Flow陽(yáng)離子交換層析上的分離純化過(guò)程為例，研究了它們的分離純化策略。對(duì)于圖譜類型Ⅰ，主要根據(jù)層析介質(zhì)有效柱容量采用流穿模式進(jìn)行洗脫，使少量蛋白達(dá)到濃縮富集的目的。對(duì)于圖譜類型Ⅱ，主要采用吸附模式進(jìn)行步級(jí)梯度洗脫方式進(jìn)行；在三組分混合樣品的分離純化策略研究中，以豬血紅蛋白、溶菌酶和胰蛋白酶在SPSepharoseFast—Flow強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析上的分離純化過(guò)程為例，研究

3、了它們的分離純化策略。對(duì)三組分混合物的分離純化過(guò)程，可以歸納為三種分離純化策略：純化策略Ⅰ：采用一步流穿模式純化：純化策略Ⅱ：采用步級(jí)梯度洗脫純化；純化策略Ⅲ：采用兩步流穿模式純化。采用以上分離純化策略得到的豬血紅蛋白和溶菌酶經(jīng)凝膠排阻高效液相色譜(SEC—HPLC)檢測(cè)純度均達(dá)到99.9％以上，離子交換高效液相色譜(IEX—HPLC)檢測(cè)純度均達(dá)到95％以上，回收率都在93％以上，且目標(biāo)產(chǎn)物均可不同程度的濃縮。通過(guò)經(jīng)濟(jì)效益分析，新的純

4、化策略比傳統(tǒng)純化策略產(chǎn)量均高出10倍以上，縮短了單次純化時(shí)間并擴(kuò)大了單位時(shí)間的產(chǎn)量。 在從豬全血中純化高純度豬血紅蛋白的分離純化策略研究中，通過(guò)對(duì)緩沖體系種類、緩沖體系pH值、鹽離子強(qiáng)度、動(dòng)態(tài)柱容量等條件的優(yōu)化，以及對(duì)比吸附模式和流穿模式分離純化結(jié)果的分析，最終選擇DEAESepharoseFast—Flow陰離子交換層析介質(zhì)為固定相，以20.0mmol/L磷酸緩沖液+0.16mol/LNaCl(pH8.0)上樣流穿洗脫至雜質(zhì)飽

5、和層析柱后，再以20.0mmol/L磷酸緩沖液+1.0mol/LNaCl(pH8.0)洗脫雜質(zhì)。純化后的Hb經(jīng)TSK—GELG3000SWXL檢測(cè)純度99.99％，Shim—PackWAX-1檢測(cè)純度為97.86％，SDS—PAGE檢測(cè)達(dá)到電泳純，并未檢測(cè)出磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺，全部指標(biāo)均達(dá)到美國(guó)FDA對(duì)基于血紅蛋白的紅細(xì)胞代用品的原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 在從戊二醛聚合豬血紅蛋白中去除低分子量血紅蛋白的分離純化策略研究中，分別對(duì)它

6、們?cè)赟ephadexG-75凝膠排阻層析、排阻限為10kD的中空纖維柱超濾和DEAESepharoseFast—Flow陰離子交換層析三種純化方法上的工藝路線進(jìn)行了對(duì)比，最終選擇了DEAESepharoseFast—Flow陰離子交換層析。優(yōu)化后的層析分離純化條件為：以20.0mmol/LPB+0.06mol/LNaCl(pH7.3)作為平衡緩沖液，以NaCl溶液進(jìn)行線性梯度洗脫，最后再以20.0mmol/LPB+1.0mol/LNaC