木糖異構(gòu)酶基因xylA在谷氨酸棒桿菌中的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、利用廉價(jià)、儲(chǔ)量豐富的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)生產(chǎn)液體燃料,對(duì)于解決當(dāng)前能源危機(jī)和環(huán)境問(wèn)題具有重大意義。木質(zhì)纖維原料經(jīng)預(yù)處理和水解后會(huì)產(chǎn)生大量的葡萄糖和木糖,其中木糖比重最高可達(dá)20％,然而自然界中的微生物普遍不能以木糖作為發(fā)酵底物,這一問(wèn)題已成為發(fā)展木質(zhì)纖維原料生物煉制的主要瓶頸。谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)是當(dāng)前氨基酸和核酸工業(yè)的主要生產(chǎn)菌株,在細(xì)胞生長(zhǎng)停滯的狀態(tài)下,仍能大量合成乳酸、琥珀酸等高附加值

2、產(chǎn)物,且對(duì)木質(zhì)纖維原料預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的抑制物具有良好的耐受性,但目前分離出的谷氨酸棒桿菌都由于缺失木糖異構(gòu)酶的編碼基因xylA而不能代謝木糖。由此,本論文擬通過(guò)基因工程手段,將大腸桿菌MG1655的xylA基因?qū)牍劝彼岚魲U菌ATCC13032菌株中進(jìn)行表達(dá),從而構(gòu)建谷氨酸棒桿菌木糖代謝工程菌。
　　首先通過(guò)PCR擴(kuò)增得到大腸桿菌MG1655的xylA基因,并將其克隆于穿梭表達(dá)載體pEC-XK99E上,構(gòu)建得到的質(zhì)粒pEC(la

3、cI-)-xylA分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21和谷氨酸棒桿菌ATCC13032,并通過(guò)蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和木糖異構(gòu)酶酶活測(cè)定,對(duì)xylA在轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明異源基因僅在大腸桿菌BL21中獲得了成功表達(dá)。
　　谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌在基因表達(dá)、調(diào)控機(jī)制上本身存在差異,表達(dá)載體上的大腸桿菌強(qiáng)啟動(dòng)子Ptrc在谷氨酸棒桿菌中的活性較低可能是導(dǎo)致xylA基因在谷氨酸棒桿菌ATCC13032中表達(dá)失敗的主要原因。為