木霉菌REMI突變株構建與抑草功能分析.pdf

1、本文通過REMI插入突變技術，以Trichoderma atrovirideT23為出發(fā)菌，獲得了18個轉化子，并經(jīng)過繼代培養(yǎng)、PCR擴增和Southern blot，證明線性pV2質(zhì)粒DNA己成功插入木霉菌基因組，利用優(yōu)化的木霉菌分子改良技術體系，為今后克隆抑草素相關基因奠定了重要基礎。從REMI創(chuàng)制的109個木霉菌突變株中，篩選出了8株有抑草活性轉化子(TaA2,TaB3,TaB7,TaE2,TaE8,TaH8,TaJ6和TaJ9)

2、，其發(fā)酵液具有抑制稗草的活性，并對水稻生長安全。在進一步篩選抑草活性穩(wěn)定的轉化子的試驗中，經(jīng)過對發(fā)酵產(chǎn)物細分為分生孢子、超聲波PBS法破碎孢子和發(fā)酵液(去除孢子)，分別對稗草生長的生物活性測試，由此獲得的轉化子TaB3為抑制作用最穩(wěn)定最明顯。 分析目標菌株TaB3鑒定轉化子分泌抑草素活性組分，為創(chuàng)制新型生物除草劑奠定基礎。本研究開展萃取試驗，將萃取液和萃取余液分別進行了稗草根部生長的抑制活性測試。研究表明：氯仿相對稗草根部生長沒

3、有表現(xiàn)出抑制作用，而在萃取余液對稗草根生長的活性測試中，表現(xiàn)出一定的抑制作用，抑制率為22.04％。乙酸乙酯作為萃取劑的試驗中，出現(xiàn)了類似的結果，即乙酸乙酯相對稗草根部生長沒有表現(xiàn)出抑制作用，而在萃取余液對稗草根生長的活性測試中，表現(xiàn)出一定的抑制作用，抑制率為10.51％。經(jīng)過高效液相色譜(HPLC)分析，結果證明：發(fā)酵液提取物中沒有檢測出二氫綠膠霉素。經(jīng)過丙酮和硫酸銨沉淀試驗結果證明：在稗草根生長的活性測試中，用丙酮沉淀分離的蛋白沒有

4、表現(xiàn)出抑制作用，其上清液也沒有表現(xiàn)出抑制作用；而用硫酸銨沉淀所分離的蛋白對稗草根部抑制作用表現(xiàn)明顯，抑制率達到32.95％，且1％差異顯著。在進一步的分級沉淀中，硫酸銨50％-100％飽和度分離的蛋白對稗草根部的抑制率達到39.60％，且5％差異顯著。本研究認為REMI轉化子TaB3產(chǎn)生的一種抑草素物質(zhì)基本上不是早先報道的綠膠霉素的衍生物二氫綠膠霉素，而可能是某種蛋白類物質(zhì)。為了尋找轉化子中與抑草素相關基因，本研究通過Southern