木霉菌REMI突變株構(gòu)建與抑草功能分析.pdf

1、本文通過REMI插入突變技術(shù)，以Trichoderma atrovirideT23為出發(fā)菌，獲得了18個(gè)轉(zhuǎn)化子，并經(jīng)過繼代培養(yǎng)、PCR擴(kuò)增和Southern blot，證明線性pV2質(zhì)粒DNA己成功插入木霉菌基因組，利用優(yōu)化的木霉菌分子改良技術(shù)體系，為今后克隆抑草素相關(guān)基因奠定了重要基礎(chǔ)。從REMI創(chuàng)制的109個(gè)木霉菌突變株中，篩選出了8株有抑草活性轉(zhuǎn)化子(TaA2,TaB3,TaB7,TaE2,TaE8,TaH8,TaJ6和TaJ9)

2、，其發(fā)酵液具有抑制稗草的活性，并對(duì)水稻生長(zhǎng)安全。在進(jìn)一步篩選抑草活性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子的試驗(yàn)中，經(jīng)過對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物細(xì)分為分生孢子、超聲波PBS法破碎孢子和發(fā)酵液(去除孢子)，分別對(duì)稗草生長(zhǎng)的生物活性測(cè)試，由此獲得的轉(zhuǎn)化子TaB3為抑制作用最穩(wěn)定最明顯。 分析目標(biāo)菌株TaB3鑒定轉(zhuǎn)化子分泌抑草素活性組分，為創(chuàng)制新型生物除草劑奠定基礎(chǔ)。本研究開展萃取試驗(yàn)，將萃取液和萃取余液分別進(jìn)行了稗草根部生長(zhǎng)的抑制活性測(cè)試。研究表明：氯仿相對(duì)稗草根部生長(zhǎng)沒

3、有表現(xiàn)出抑制作用，而在萃取余液對(duì)稗草根生長(zhǎng)的活性測(cè)試中，表現(xiàn)出一定的抑制作用，抑制率為22.04％。乙酸乙酯作為萃取劑的試驗(yàn)中，出現(xiàn)了類似的結(jié)果，即乙酸乙酯相對(duì)稗草根部生長(zhǎng)沒有表現(xiàn)出抑制作用，而在萃取余液對(duì)稗草根生長(zhǎng)的活性測(cè)試中，表現(xiàn)出一定的抑制作用，抑制率為10.51％。經(jīng)過高效液相色譜(HPLC)分析，結(jié)果證明：發(fā)酵液提取物中沒有檢測(cè)出二氫綠膠霉素。經(jīng)過丙酮和硫酸銨沉淀試驗(yàn)結(jié)果證明：在稗草根生長(zhǎng)的活性測(cè)試中，用丙酮沉淀分離的蛋白沒有

4、表現(xiàn)出抑制作用，其上清液也沒有表現(xiàn)出抑制作用；而用硫酸銨沉淀所分離的蛋白對(duì)稗草根部抑制作用表現(xiàn)明顯，抑制率達(dá)到32.95％，且1％差異顯著。在進(jìn)一步的分級(jí)沉淀中，硫酸銨50％-100％飽和度分離的蛋白對(duì)稗草根部的抑制率達(dá)到39.60％，且5％差異顯著。本研究認(rèn)為REMI轉(zhuǎn)化子TaB3產(chǎn)生的一種抑草素物質(zhì)基本上不是早先報(bào)道的綠膠霉素的衍生物二氫綠膠霉素，而可能是某種蛋白類物質(zhì)。為了尋找轉(zhuǎn)化子中與抑草素相關(guān)基因，本研究通過Southern