哈維氏弧菌寡肽透性酶原核表達(dá)、突變株構(gòu)建及其性質(zhì)研究.pdf

1、哈維氏弧菌是一種革蘭氏陰性菌,是發(fā)光弧菌的主要成員之一。在海洋環(huán)境及魚、甲殼類和無脊椎動(dòng)物等海洋動(dòng)物中廣泛存在。許多國家爆發(fā)的大規(guī)模性對(duì)蝦死亡及中國和南亞一些國家報(bào)道的魚的致病都跟哈維氏弧菌有關(guān)。
　　 一些革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌有三套肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),以幫助它運(yùn)輸多種底物,滿足其對(duì)氮源寬泛的需求。這三個(gè)系統(tǒng)為二肽透性酶(Dpp),三肽透性酶(Tpp)和寡肽透性酶(Opp)。寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)屬于ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)家族全轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白型,由5個(gè)亞基組

2、成:1個(gè)胞外寡肽結(jié)合蛋白(oppA),它負(fù)責(zé)與進(jìn)入細(xì)胞的底物特異性地結(jié)合,將其傳輸給轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(translocator)；形成運(yùn)輸通道的2個(gè)跨膜蛋白(oppB／oppC)；2個(gè)核酸結(jié)合區(qū)(oppD／oppE)。它是一個(gè)溶質(zhì)結(jié)合蛋白,不僅為細(xì)菌生長提供碳源和氮源,還參與胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。越來越多的證據(jù)顯示ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與細(xì)菌的致病性相關(guān)。
　　 從哈維氏弧菌SF-1基因組中用PCR擴(kuò)增得到特異性片段,含寡肽結(jié)合蛋白基因,該基因全長1

3、665 bp,編碼554個(gè)氨基酸。以哈維氏弧菌SF—1基因組DNA為模板,將擴(kuò)增的基因片段與克隆載體pMD-19T連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒并測序,序列分析發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)傷弧菌,副溶血弧菌,河弧菌等的寡肽結(jié)合蛋白具有很高的相似性；將目的片段與表達(dá)載體pET-28a(+)連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),用鎳親和層析純化重組蛋白,SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)破碎的菌體和上清中均表達(dá)出大小為58 kDa左右的目的蛋白。
　

4、　 純化的重組寡肽結(jié)合蛋白具有磷脂酶C活性和溶血活性。蛋白磷脂酶C活性的最適溫度為55℃,當(dāng)高于46℃時(shí),酶活力急劇下降。在66℃時(shí),磷脂酶的活力幾乎全部喪失。酶的最適反應(yīng)pH值為8.0,在pH為7.0時(shí),酶活力比較穩(wěn)定。將純化的蛋白注射斑馬魚,導(dǎo)致魚的死亡,魚鰓部和腹部均有出血現(xiàn)象,表明該蛋白具有致病性。
　　 擴(kuò)增寡肽透性酶基因ORF97-604區(qū)間507 bp的片段,連接克隆載體pMD-19T,并連接自殺質(zhì)粒pNQ705