德氏乳桿菌發(fā)酵性能研究及發(fā)酵工藝優(yōu)化.pdf

1、目前，我國用于生產(chǎn)酸奶的直投式發(fā)酵劑多為進口。開發(fā)、生產(chǎn)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的高活性、低成本酸奶直投式發(fā)酵劑備受國內(nèi)學(xué)者關(guān)注。直投式酸奶發(fā)酵劑的開發(fā)與生產(chǎn)需要經(jīng)過優(yōu)良菌種的篩選和選育，菌株的增殖培養(yǎng)，菌體的濃縮分離與收集，菌體的冷凍干燥與保護等重要環(huán)節(jié)。篩選發(fā)酵性能優(yōu)良、活力較高、能夠制備高品質(zhì)酸奶的菌種是開發(fā)、生產(chǎn)直投式發(fā)酵劑的前提。德氏乳桿菌保加利亞亞種(通常簡稱為：保加利亞乳桿菌)作為生產(chǎn)酸奶的主要菌種之一，通過發(fā)酵鮮奶產(chǎn)酸、產(chǎn)胞

2、外多糖以及特征性風味物質(zhì)，賦予酸奶獨特的風味、良好的質(zhì)地和細膩的口感。優(yōu)良保加利亞乳桿菌同時具備發(fā)酵產(chǎn)酸速度快、貯藏期間后酸化弱、制備的酸奶黏度高、感官品質(zhì)評價好等特點。菌體高密度培養(yǎng)是開發(fā)、生產(chǎn)直投式發(fā)酵劑的關(guān)鍵。通過培養(yǎng)基的改良、培養(yǎng)條件的優(yōu)化實現(xiàn)保加利亞乳桿菌的菌體增殖，使其活菌數(shù)在液體培養(yǎng)基中可達109CFU/mL以上，從而接近國際水平。
　　 本課題對重點實驗室前期鑒定的德氏乳桿菌保加利亞亞種進行優(yōu)選，并對優(yōu)選菌株的高

3、密度培養(yǎng)基進行了研究，為菌株開發(fā)成直投式酸奶發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。
　　 通過16S rRNA基因序列的分析，對實驗菌株L1、L7、L12、L15重新進行分子生物學(xué)鑒定，證實用于實驗的菌株均為德氏乳桿菌保加利亞亞種。在100g/L的脫脂乳中，對實驗菌株產(chǎn)酸速率、后酸化程度進行測定，菌株L7的產(chǎn)酸速率最快為13.4 OT/h、菌株L12其次、菌株L1最為緩慢僅為6.0 OT/h；在不同溫度條件下貯藏測定各菌株的后酸化特性，結(jié)果顯示：低溫

4、貯藏可以有效抑制菌株的后酸化現(xiàn)象，其中菌株L7后酸化最為嚴重、菌株L15低溫貯藏期間后酸化程度最弱。為了進一步篩選優(yōu)良菌株，使用單菌株、組合菌株發(fā)酵酸奶，并對酸奶的酸度、質(zhì)構(gòu)及感官進行評價。不論是單菌株間酸奶品質(zhì)評價，還是組合菌株間酸奶品質(zhì)的評價都顯示實驗菌株L7、菌株L15制作的酸奶黏度高、口感好且香味濃厚，其中L15S1組合、L7S1組合制作的酸奶與市售酸奶口感風味較為接近，完全具備開發(fā)成酸奶發(fā)酵劑的前提。
　　 通常情況下

5、，應(yīng)用在保加利亞乳桿菌高密度培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是MRS、乳清粉或脫脂乳。其中MRS成本較高、乳清粉營養(yǎng)不足、脫脂乳雖然營養(yǎng)全面但不宜于后期的菌體分離。為了降低培養(yǎng)基的成本、提高活菌數(shù)且便于菌體分離，采用6％的酶解脫脂乳為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過添加乳清粉補充碳源和部分氮源、添加酵母粉補充多種促生長因子、添加碳酸鈣中和發(fā)酵液中的乳酸，從而實現(xiàn)菌體的高密度培養(yǎng)。通過最陡爬坡實驗按梯度添加乳清粉、酵母粉和碳酸鈣，以最快的速度逼近優(yōu)選保加利亞乳桿菌菌株L

6、7、菌株L15菌體收獲最高密度的區(qū)域。使用Design Expert8.05b軟件的Box-Behnken設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實驗，并通過標準多項式回歸方法，對實驗數(shù)據(jù)進行擬合，得到一個二次多項式，進一步建立二次響應(yīng)面回歸模型，可用以下模型方程來表示在6%酶解脫脂乳基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同量的乳清粉、酵母粉、碳酸鈣得到的12h菌株L7活菌數(shù)：
　　 Y=178.80+16.63A+0.13B+14.75C-0.50AB-5.7

7、5AC+11.75BC-61.40A2-19.90B2-22.15C2
　　 同理，菌株L15在18h獲得的活菌數(shù)擬合模型方程為：
　　 Y=350.60+22.13A+19.25B+8.88C-7.75AB-2.00AC+23.25 BC-27.55 A2-32.80 B2-27.05C2
　　 進一步對改良培養(yǎng)基在更大范圍內(nèi)進行優(yōu)化，其中乳清粉的取值范圍是20g/L～80 g/L、酵母粉的取值范圍是5g/L～

8、20 g/L、碳酸鈣的取值范圍是1.0g/L～5.0 g/L時，分別以菌株L7在12h和菌株L15在18h獲得的最高活菌數(shù)為目標，對各因素最低的添加量進行優(yōu)化，得到菌株L7高密度培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基是在6%的酶解脫脂乳中添加49.14g/L的乳清粉、6.63g/L的酵母粉和1.51g/L的碳酸鈣；菌株L15高密度培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基是在6%的酶解脫脂乳中添加58.21g/L乳清粉、10.44g/L的酵母粉和2.43 g/L的碳酸鈣。在這兩種培養(yǎng)