利用德氏保加利亞乳桿菌發(fā)酵脫脂乳生產(chǎn)生物活性肽及其體外生理功能初步研究.pdf

1、乳源生物活性肽是一類由2-20aa組成的短肽段,它能對機(jī)體健康產(chǎn)生積極影響,例如,抗高血壓、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等。這些短肽通常隱匿在母體蛋白中,需要通過微生物發(fā)酵或蛋白酶水解的方式釋放后,才能發(fā)揮相應(yīng)的活性。但發(fā)酵產(chǎn)物和酶水解產(chǎn)物成份非常復(fù)雜,所以從其中分離純化得到這些活性非常困難。因此,全面評價(jià)益生菌的發(fā)酵乳制品的產(chǎn)肽組分的體外生理活性,對衡量發(fā)酵乳制品的營養(yǎng)價(jià)值提升具有重要的意義。本文利用德氏保加利亞乳桿菌LB340 LYO,對脫脂乳

2、進(jìn)行了發(fā)酵,從發(fā)酵工藝的優(yōu)化、小肽組分的分離純化和體外生理功效評價(jià)等方面進(jìn)行了探討,為利用德氏保加利亞乳桿菌LB340 LYO生產(chǎn)功能肽乳制品奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1)根據(jù)目標(biāo)小肽的來源和分子量分布對小肽濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行篩選,最終確定酪蛋白的胃蛋白酶水解產(chǎn)物Peptone為最適標(biāo)準(zhǔn)物,建立了乳源小肽的濃度相對準(zhǔn)確的測定方法:Peptone-Folin酚法。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.48158X,其中Y為吸光值,X為混合小肽濃度

3、。線性相關(guān)系數(shù)R=0.99936,說明結(jié)果具有很好的相關(guān)性,可用于樣品濃度的測定。2)以產(chǎn)肽量和目標(biāo)區(qū)段小肽豐度為指標(biāo),從菌種配比、發(fā)酵時(shí)間和后熟工藝三個(gè)方面對德氏保加利亞乳桿菌LB340 LYO發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化,最后確定其最佳產(chǎn)肽條件為:單一LB340 LYO菌株,42℃培養(yǎng)16h,不采用后熟工藝。3)利用離心、超濾、凝膠層析和反相高效液相色譜對發(fā)酵產(chǎn)物中的小肽組分分別進(jìn)行了分離與純化,獲得的≤1kDa的小肽的組分的濃度為3.655

4、μg/μL。對1kDa樣品進(jìn)一步凝膠層析分離,獲得F1-F6六個(gè)組分峰,其中F2組分表現(xiàn)出最高的ACE抑制活性,其半抑制濃度為67.79μg/μL。通過RP-HPLC對F2進(jìn)一步分離,得到四個(gè)組分F2-1、F2-2、F2-3和F2-4。在2μg/mL的濃度下均表現(xiàn)出良好的ACE抑制活性,其抑制率為22.19％、24.35%、21.66%和18.77%。MTT實(shí)驗(yàn)表明,≤1kDa超濾液對小鼠淋巴細(xì)胞增殖有正向刺激作用,進(jìn)一步分離得到得F1

5、、F3、F4、F6組分能夠刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖,其刺激指數(shù)(SI)分別為0.014、0.096、0.646和0.729。然而,F5組分具有明顯的負(fù)調(diào)控影響,表明樣品具有一定的抗超敏反應(yīng)作用。此外這些按分子量分級超濾分離樣品的抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各級超濾液都能夠清除[DPPH*]自由基,其中作用最高的為5kDa超濾產(chǎn)物,自由基清除率達(dá)65.98%,顯著高于其他組分。FRAP分析表明相同樣品也具有一定的還原力,但未見其與抗氧化能力之間