巖藻聚糖硫酸酯酶產(chǎn)生菌的篩選、酶學(xué)性質(zhì)研究及酶解產(chǎn)物抗氧化活性預(yù)測系統(tǒng)的建立.pdf

1、海帶是我國重要的經(jīng)濟(jì)藻類，因其營養(yǎng)價(jià)值高，具有多種生理活性，受到人們的喜愛。目前，我國海帶產(chǎn)量居世界第一位，但海帶的工業(yè)利用率僅有30％，并且整體加工水平較低，導(dǎo)致海帶產(chǎn)業(yè)始終無法發(fā)展壯大。因此，對海帶的生理活性成分進(jìn)行深入研究，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)海帶的高值化利用，是發(fā)展海帶產(chǎn)業(yè)的重要途徑。本文圍繞海帶中的活性物質(zhì)巖藻聚糖硫酸酯（HDFuc）及其降解產(chǎn)物展開研究，鑒于低分子量HDFuc在活性應(yīng)用以及結(jié)構(gòu)研究方面的優(yōu)勢，對HDFuc進(jìn)行降解進(jìn)而獲取

2、低分子量的HDFuc成為重要的課題。酶法降解是最理想的方式，但是由于相應(yīng)商品酶制劑的缺乏，目前無法實(shí)現(xiàn)對HDFuc的酶法降解。
　　本文首先進(jìn)行產(chǎn)酶微生物的篩選。以HDFuc為唯一碳源，從榮成海域海帶中篩選出一株產(chǎn)酶細(xì)菌RC2，經(jīng)過生理生化和16s rDNA鑒定，判斷RC2為黃桿菌科的一個新成員。RC2能夠穩(wěn)定產(chǎn)生巖藻聚糖硫酸酯酶（FUCenzyme），該酶屬于胞內(nèi)酶。經(jīng)過高效凝膠排阻色譜及薄層色譜的方法確認(rèn)了RC2的產(chǎn)酶能力，并

3、證實(shí)該酶能夠?qū)DFuc降解為低分子量產(chǎn)物。
　　為了提高RC2的產(chǎn)酶能力，對其發(fā)酵培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。確定RC2產(chǎn)酶最優(yōu)培養(yǎng)基配方為0.2%HDFuc、0.4%牛肉膏、用過膜海水配制；最優(yōu)培養(yǎng)條件為25℃、pH值自然、搖床轉(zhuǎn)速150rpm、250mL三角瓶裝液量20%、接種量10%。在上述條件下，菌株RC2培養(yǎng)72h后產(chǎn)酶活力可達(dá)178U/mL，該酶活力高于所有已報(bào)道的有可比性的細(xì)菌。并在此基礎(chǔ)上，對RC2進(jìn)行了5L發(fā)酵罐

4、擴(kuò)大發(fā)酵試驗(yàn)，在25℃，攪拌速度200rpm，通氣量2.0L/min的條件下，經(jīng)過96h的培養(yǎng)后收集菌體并進(jìn)行細(xì)胞破碎，可獲得總酶活力110530U。
　　隨后，對FUCenzyme進(jìn)行了分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研究。胞內(nèi)酶經(jīng)過硫酸銨沉淀和Q-Sepharose Fast F low離子交換層析純化，可得到單一酶活性組分，對該組分進(jìn)行 S DS-PAG E檢測，結(jié)果為單一條帶，證明得到了純化酶。通過分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其分子量為41.0K

5、Da。純化過程總的酶活力回收率為11.3%，純化倍數(shù)為11.8倍。經(jīng)酶學(xué)性質(zhì)分析表明，該酶最適反應(yīng)溫度為50℃；熱穩(wěn)定性較差，僅在20℃和30℃穩(wěn)定，但在4℃穩(wěn)定性很好，酶活力保持一個月無顯著性下降。酶的最適反應(yīng)pH值為8.0；在pH8.0最穩(wěn)定，其次為pH7.0。該酶必須在NaCl存在下才能夠顯示酶活力，最適NaCl濃度為0.4mol/L或0.6mol/L。Zn2+、K+、Ca2+對該酶有激活作用，其中Zn2+激活作用最強(qiáng)；Cu2+、

6、Hg2+、Ag+對該酶有較大抑制作用，其中Cu2+的抑制作用最強(qiáng)。另外，NaF和EDTA-2Na對該酶有較強(qiáng)的抑制作用。另外，還監(jiān)測了該酶催化過程還原糖含量的變化，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)12h內(nèi)還原糖明顯上升，12h后變化較小，說明酶催化反應(yīng)速率在12h以后減慢。
　　利用純化酶對HDF uc進(jìn)行酶解，首次建立了酶解產(chǎn)物抗氧化活性可視化預(yù)測系統(tǒng)。利用三個BP網(wǎng)絡(luò)模型分別實(shí)現(xiàn)了對酶解過程產(chǎn)物的DPPH˙清除率、˙O H清除率和O2˙-清除率的預(yù)測

7、。經(jīng)驗(yàn)證，三個 BP網(wǎng)絡(luò)模型的最大誤差均小于10%，完全能夠滿足應(yīng)用要求，并在Matlab平臺建立了抗氧化活性可視化預(yù)測系統(tǒng)。進(jìn)一步應(yīng)用遺傳算法對BP網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行尋優(yōu)，確定最佳酶解條件為25.2℃，酶解6.4h，加酶量22.0U/(mg HDFuc)，此時酶解產(chǎn)物的DPPH˙、˙OH和O2˙-清除率分別為39.85±1.00%、82.08±5.74%、27.67±3.45%，還原能力為0.2348±0.0044，金屬離子螯合能力達(dá)到35

8、.64±3.01%。
　　對 HDFuc及其酶解產(chǎn)物進(jìn)行體內(nèi)抗氧化活性研究。在最優(yōu)酶解條件下對HDFuc進(jìn)行酶解，獲得酶解產(chǎn)物。通過建立D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠亞急性衰老模型，評估了二者的體內(nèi)抗氧化活性。結(jié)果表明二者均具有顯著的抗氧化活性，酶解產(chǎn)物在保護(hù)小鼠血清抗氧化酶活性方面的作用要優(yōu)于HDFuc。
　　綜上所述，本文成功篩選到FUCenzyme產(chǎn)酶細(xì)菌，并對該酶進(jìn)行了分離純化。利用該酶獲得低分子量的酶解產(chǎn)物，首次建立了HDF