甘油氧化酶高產(chǎn)菌株的篩選、酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、甘油氧化酶(Glycerol Oxidase，GLOX)在氧氣存在的情況下，可將甘油氧化為甘油醛，同時產(chǎn)生過氧化氫。甘油氧化酶可以替代甘油激酶和甘油磷酸氧化酶對血液中的甘油三酯進(jìn)行測定。甘油氧化酶還可將乙二醇經(jīng)由羥乙醛氧化為乙二醛，可將乙醇酸氧化為乙醛酸。因?yàn)槊复呋磻?yīng)的速度快，無副產(chǎn)品產(chǎn)生，如將其用于工業(yè)生產(chǎn)乙二醛和乙醛酸，具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 日本曲霉(Aspergillus japonicus)是半知菌綱的絲狀真菌，

2、是產(chǎn)生甘油氧化酶的重要菌種。為了提高甘油氧化酶的產(chǎn)量，本研究首先利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)T-DNA轉(zhuǎn)化真菌引起插入突變的原理，構(gòu)建了日本曲霉突變體文庫，對該文庫中的332株日本曲霉轉(zhuǎn)化子進(jìn)行甘油氧化酶產(chǎn)量檢測，篩選到4株產(chǎn)量提高的轉(zhuǎn)化子，其中Ajyz0079較初始菌株As5999甘油氧化酶產(chǎn)量提高了50％，搖瓶條件下Ajyz0079甘油氧化酶活力達(dá)到10.02U。
　　 對日本曲霉

3、生產(chǎn)甘油氧化酶的搖瓶和10L罐體發(fā)酵條件進(jìn)行研究。確定日本曲霉生產(chǎn)甘油氧化酶的搖瓶發(fā)酵條件為：107個日本曲霉孢子接入已滅菌的裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃、180r/min發(fā)酵培養(yǎng)24h；10L罐體發(fā)酵條件為：109個孢子接種到滅菌后裝有8L發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，30℃，風(fēng)量450L/h，灌壓0.03-0.04Mp，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵18h。
　　 通過收集菌體，液氮研磨，硫酸銨沉淀，S

4、ephadex G-25凝膠色譜柱脫鹽，HiTrap Q HP離子交換層析和瓊葡糖G-200 FF凝膠過濾層析對甘油氧化酶進(jìn)行了分離純化，純化后甘油氧化酶蛋白純度達(dá)98.98%，比活達(dá)到38U/mg。經(jīng)SDS-PAGE確定甘油氧化酶單體分子量為66kDa，推測其由六個分子量為66kDa的亞基組成。
　　 甘油氧化酶在以甘油為底物時，最適作用溫度為37℃，溫度對酶活力影響較大，隨溫度升高酶活力逐漸降低；最適pH為7.0，在pH9.