產(chǎn)芳基硫酸酯酶菌株的篩選及酶學性質研究.pdf

1、芳基硫酸酯酶(Arylsulfatase)是一種催化裂解硫酸酯鍵,生成相應的醇和無機硫酸根的酶,該酶可以脫除瓊膠分子中的硫酸根,進而可以替代對環(huán)境污染嚴重、產(chǎn)品得率低的化學方法,用于制備高品質的瓊脂糖。本文以對硝基苯酚硫酸酯鉀鹽(pNPS)為篩選底物,首次從青島海域紅藻中分離篩選出一株能高效分泌芳基硫酸酯酶的菌株。該菌株經(jīng)革蘭氏染色為陰性,需氧,彎桿狀,生理生化特征驗證及16S rDNA序列分析確定為海單胞菌屬,并將其命名為Marino

2、monas sp. FW-1,簡稱FW-1。
　　證實了菌株FW-1的產(chǎn)酶能力后,選取常用的pNPS法對其產(chǎn)酶能力進行定量分析。采用單因素-響應面方法對菌株 FW-1產(chǎn)芳基硫酸酯酶的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化。結果表明,其最佳培養(yǎng)基組分為(w/v):瓊脂0.2％,酵母膏0.2%,蛋白胨0.5%, NaCl2.89%, MgCl2·6H200.412%, KCl0.1%, CaCl20.02%,K2HPO4·3H200.013%,

3、FeCl2·4H2O0.002%,MnCl20.09%,焦磷酸鈉0.043%,吐溫-801.87%;最佳培養(yǎng)條件如下:初始 pH為7,培養(yǎng)溫度為35℃,發(fā)酵時間為72h,接種量為1%,250mL錐形瓶裝液量為50mL。在上述最佳培養(yǎng)基成分及最佳培養(yǎng)條件下,菌株 FW-1的產(chǎn)酶能力為1.07U/mL,酶活力相對于優(yōu)化前提高了4.28倍。
　　菌株 FW-1能夠穩(wěn)定地產(chǎn)生芳基硫酸酯酶,該酶主要位于菌體細胞內部,在最適培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)

4、72h后,發(fā)酵液經(jīng)低溫離心、超聲波細胞破碎、硫酸銨分級沉淀、透析除鹽、超濾濃縮、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳原位檢測及分離后得到粗酶液。純度鑒定及分子量測定表明該酶的分子量約為60kDa。酶學性質實驗表明,芳基硫酸酯酶的最適反應溫度和 pH分別是45℃和11。該酶在4℃以下保存時較為穩(wěn)定,在4℃放置72h后,酶活仍保留在95%以上,酶的熱穩(wěn)定良好,25℃保溫48h后,酶活剩余90%左右,但當溫度大于35℃時,6h以后酶活就開始急劇下降。該酶

5、在 pH為7.0~11.0時具有良好的穩(wěn)定性。當金屬離子濃度為0.1mM/L時,K+、Ba2+和 Ca2+對芳基硫酸酯酶酶活力具有顯著的促進作用, Hg2+能夠抑制芳基硫酸酯酶酶活力,酶活下降了59%;當離子濃度為1mM/L時,Ba2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+及 Ca2+對芳基硫酸酯酶酶活力具有顯著的促進作用, Hg2+同樣能夠有效地抑制芳基硫酸酯酶酶活力,酶活大幅度下降了80%。利用純化后的芳基硫酸酯酶對瓊膠進行酶解實驗,結果表