MicroRNA-214抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞膠原分泌.pdf

1、目的:心肌梗死是冠狀動脈持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，嚴重危害人類的健康。心肌梗死后發(fā)生心室重構、導致心肌肥大，心肌纖維化，最終形成心力衰竭。多年來雖有許多治療方法，包括介入、藥物治療、外科手術等等，還包括嘗試干細胞移植在內的先進技術，但無法中斷心衰的進展，因此尋求更有效更先進的治療方法已成為一項艱巨的任務。近幾年，基因治療越來越被人們廣泛接受，大量文獻顯示microRNAs(miRNAs)參與調控細胞增殖、分化、凋亡和代謝過程。最近

2、miRNAs與心血管疾病的研究逐漸增多，其中microRNA-214(miR-214)是新發(fā)現(xiàn)的因子。近期有研究報道m(xù)iR-214對心肌有保護作用，但對心肌成纖維細胞的作用機制尚不清楚。當心肌收縮力減弱時，心臟排血量降低，腎血流量隨之減低，從而腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(rein-angiotensin-aldosterone system，RAAS)被激活。RAAS被激活后，血管緊張素（Angiotensin，AngⅡ）分泌增加，刺

3、激成纖維細胞分泌膠原蛋白，使膠原纖維合成增多，促使心肌間質纖維化，發(fā)生心室重構。因此本研究采用AngⅡ刺激心肌成纖維細胞(cardiacfibroblasts，CFS)，建立心肌成纖維細胞纖維化模型，通過細胞轉染miR-214來觀察miR-214對AngⅡ刺激CFS纖維化的作用，意圖尋找出延緩心室重構，抑制心肌纖維化的有效方法。
　　方法:
　　1.心肌成纖維細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定取出生1-3天的SD乳大鼠，低溫麻醉，取出心

4、室肌組織剪成小塊，用胰酶消化法通過差時貼壁分離培養(yǎng)心肌成纖維細胞，用波形蛋白(Vimentin)來鑒定其純度。
　　2.不同濃度不同時間AngⅡ對心肌成纖維細胞的作用取原代心肌成纖維細胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時，饑餓24小時后，用AngⅡ刺激CFS。實驗分正常對照組(normal control)，AngⅡ作用組(AngⅡgroup，濃度分別為10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，作用時間為24小時)，通過MTT比色法檢測各組

5、細胞增殖能力;再取適當濃度，作用不同時間(6h、12h、24h)，同樣用MTT比色法檢測各組細胞增殖能力。
　　3.不同濃度AngⅡ誘導后CFS分泌膠原的變化取原代心肌成纖維細胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時，饑餓24小時后，用AngⅡ刺激CFS。實驗分組（同方法2）:正常對照組(normal control)，AngⅡ作用組（AngⅡgroup，濃度分別為10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，作用時間為24小時），通過羥脯氨酸測試

6、盒檢測各組細胞分泌的膠原含量;再取AngⅡ10-6mol/L濃度，作用不同時間(6h、12h、24h)，同樣用羥脯氨酸測試盒檢測各組細胞分泌的膠原含量。
　　4.Q-PCR法檢測不同濃度AngⅡ作用下的心肌成纖維細胞中miR-214的表達取原代心肌成纖維細胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時，饑餓24小時后，用AngⅡ刺激CFS。實驗分組:正常對照組(normal control)，AngⅡ作用組（AngⅡgroup，濃度分別為10-8、10-7、

7、10-6、10-5mol/L，作用時間為24小時），通過實時定量PCR法(real time PCR)測定不同濃度AngⅡ作用后成纖維細胞中miR-214的表達水平。
　　5.Q-PCR法檢測轉染miR-214后，心肌成纖維細胞中miR-214的表達取原代心肌成纖維細胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時進行細胞轉染，實驗分為五組（正常對照組、前體組、前體空白對照組、抑制劑組、抑制劑空白對照組，作用時間為24小時），通過實時定量PCR法(real t

8、ime PCR)測定各組中miR-214的表達水平。
　　6.Q-PCR法檢測細胞轉染miR-214后，再經AngⅡ誘導下的心肌成纖維細胞中COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、MMP-1、MMP-2、TIMPI-1的mRNA表達取原代心肌成纖維細胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時進行細胞轉染24小時后，進行饑餓處理再給予10-6mol/L AngⅡ刺激，然后提取總RNA。實驗分為六組（正常對照組、AngⅡ組、AngⅡ+前體組、AngⅡ+前體空白對照組

9、、AngⅡ+抑制劑組、AngⅡ+抑制劑空白對照組），通過實時定量PCR法(realtime PCR)測定各組中COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、MMP-1、MMP-2、TIMPI-1的mRNA表達水平。
　　7.Western法檢測細胞轉染miR-214后，再經AngⅡ誘導下的心肌成纖維細胞中COLⅠ、COLⅢ、MMP-1、MMP-2和TGFβ1蛋白表達取原代心肌成纖維細胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時進行細胞轉染24小時后，進行饑餓處理再給予1

10、0-6mol/L AngⅡ刺激，然后提取總蛋白。實驗分為六組（正常對照組、AngⅡ組、AngⅡ+前體組、AngⅡ+前體空白對照組、AngⅡ+抑制劑組、AngⅡ+抑制劑空白對照組），通過Western法檢測定各組中COLⅠ、COLⅢ、MMP-1、MMP-2、TGFβ1、的蛋白表達。
　　結果:
　　1.心肌成纖維細胞培養(yǎng)及鑒定心肌成纖維細胞總體呈‘S’型趨勢生長，2～4天處于對數生長期，第4天之后進入平臺期。光鏡下呈三角形，梭

11、行或多邊形;免疫組化結果顯示vimentin陽性部位可見棕黃色細絲狀或點狀細密顆粒(Vimentin)存在于細胞胞漿中，分布較均勻，純度達95％。
　　2.AngⅡ對心肌成纖維細胞活力的影響MTT檢測結果提示，心肌成纖維細胞增殖能力隨著AngⅡ濃度的升高，作用時間的延長而逐漸增強，呈明顯的劑量和時間依賴性。我們選取引起細胞增殖約50％左右的AngⅡ濃度（10-6mol/L）作用24h，建立心肌成纖維細胞纖維化模型。
　　3.

12、AngⅡ對CFS分泌膠原的影響羥脯氨酸測試盒檢測結果提示，經AngⅡ干預后，與正常對照組相比，AngⅡ(10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)組的羥脯氨酸含量隨AngⅡ濃度的升高作用時間的延長呈上升趨勢，說明心肌成纖維細胞分泌的膠原蛋白隨AngⅡ濃度的升高作用時間的延長而增多。
　　4.不同濃度AngⅡ作用對心肌成纖維細胞中miR-214表達的影響q-PCR檢測顯示，與正常對照組相比，AngⅡ組miR-214的表達水平

13、顯著下降，且隨AngⅡ濃度的升高逐漸下降。
　　5.經miR-214轉染后心肌成纖維細胞miR-214的表達q-PCR檢測顯示，轉入前體組的miR-214表達水平明顯高于前體空白對照組，而轉入抑制劑組的miR-214表達水平明顯低于抑制劑空白對照組，正常對照組與前體空白對照組、抑制劑空白對照組相比無差異，說明轉染成功。
　　6.miR-214對AngⅡ干預下的心肌成纖維細胞中COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、MMP-1、MMP

14、-2、TIMPI-1的mRNA表達的影響q-PCR檢測顯示:AngⅡ組中CFS的COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、TIMPI-1 mRNA表達水平明顯高于正常對照組(P＜0.01);AngⅡ+前體組CFS中COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、TIMPI-1mRNA表達水平明顯低于AngⅡ組（P＜0.01），而與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。在AngⅡ+抑制劑組COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、TIMPI-1 mRNA表達水平顯著高

15、于AngⅡ組(P＜0.05)。AngⅡ+前體空白對照組、AngⅡ+抑制劑空白對照組COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、TIMPI-1mRNA表達水平與AngⅡ組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。AngⅡ組中CFS的MMP-1、MMP-2mRNA表達水平明顯低于正常對照組(P＜0.05);AngⅡ+前體組中MMP-1、MMP-2mRNA表達水平明顯高于AngⅡ組(P＜0.01)，而與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。在AngⅡ+抑制

16、劑組MMP-1、MMP-2mRNA表達水平顯著低于AngⅡ組(P＜0.01)。AngⅡ+前體空白對照組、AngⅡ+抑制劑空白對照組MMP-1、MMP-2mRNA表達水平與AngⅡ組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　7.miR-214對AngⅡ干預下的心肌成纖維細胞中COLⅠ、COLⅢ、MMP-1、MMP-2和TGFβ1蛋白表達的影響Western-blot法檢測顯示:AngⅡ組中CFS的COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1蛋白表達

17、水平明顯高于正常細胞組(P＜0.05);AngⅡ+前體組CFS中COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1蛋白表達水平明顯低于AngⅡ組(P＜0.05)，而COLⅠ、COLⅢ蛋白表達水平與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，TGFβ1蛋白表達水平稍高于AngⅡ組(P＜0.05)。在AngⅡ+抑制劑組COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1蛋白表達水平顯著高于AngⅡ組(P＜0.05)。AngⅡ+前體空白對照組、AngⅡ+抑制劑空白對照組COLⅠ、CO

18、LⅢ、TGFβ1蛋白表達水平與AngⅡ組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。AngⅡ組中CFS的MMP-1、MMP-2蛋白表達水平明顯低于正常對照組（P＜0.01）;AngⅡ+前體組中MMP-1、MMP-2蛋白表達水平明顯高于AngⅡ組(P＜0.05)，而與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。在AngⅡ+抑制劑組MMP-1、MMP-2蛋白表達水平顯著低于AngⅡ組(P＜0.05)。AngⅡ+前體空白對照組、AngⅡ+抑制劑空白對照

19、組MMP-1蛋白表達水平稍低于AngⅡ組(P＜0.05)。AngⅡ+前體空白對照組、AngⅡ+抑制劑空白對照組MMP-2蛋白表達水平與AngⅡ組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　結論:
　　1.AngⅡ刺激心肌成纖維細胞產生膠原蛋白，并且呈濃度和時間依賴性。AngⅡ(10-6mol/L)作用心肌成纖維細胞24h可使活力提升50％左右。
　　2.在心肌成纖維細胞中，miR-214的表達隨AngⅡ濃度的升高而成下降趨